心肌梗死和心力衰竭等心血管疾病的發病率隨著年齡的增長而增加。衰老是導致心血管疾病發展的一個主要因素，但其潛在的分子機制在很大程度上仍然未知，原因之一是缺乏合適的動物模型。

2022年10月31日，蘇州大學心血管病研究所李楊欣教授團隊在生物醫學1區雜志《Theranostics》（IF=11.6）期刊上發表了一篇題為“circHIPK3 prevents cardiac senescence by acting as a scaffold to recruit ubiquitin ligase to degrade HuR”的研究論文，揭示了心肌修復再生的新機制。研究生丁鳳枝、陸琳和吳誠潔是論文的共同第一作者，李楊欣教授是通訊作者。
 

來源：Theranostics

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了由賽業生物提供的他莫昔芬誘導的心肌細胞特異性circHIPK3敲除小鼠。在整個實驗過程中，他們使用了RNA測序、蛋白測序、流式細胞術、心功能檢測、蛋白印跡、RNA和蛋白共沉淀、circHIPK3慢病毒表達等技術方法。

研究結果
1.circHIPK3在年輕和中年小鼠心臟中的表達及影響
研究者對不同年齡的小鼠心臟進行RNA-seq，分析得到circHIPK3來源于HIPK3基因外顯子2，是一種高表達且高度保守的circRNA。同時檢測到circHIPK3在小鼠心、肝、脾、肺和腎臟等組織中均有表達，在心臟中表達最多。隨后研究者發現circHIPK3在心臟中的表達水平隨著年齡的增長而降低，這提示了circHIPK3可能在心臟衰老的發展中發揮著重要作用（圖1）。
 

circHIPK3在年輕和中年小鼠心臟中的表達及影響^[4]

2.circHIPK3敲除誘導小鼠心臟衰老
為了證實circHIPK3在心臟衰老中的作用^[1]，研究者用賽業構建的他莫昔芬誘導心肌細胞特異性circHIPK3敲除小鼠，發現與同窩的circHIPK3^Flox/Flox小鼠相比，KO小鼠的心功能下降，小鼠端粒長度縮短，p16和p21表達增加，小鼠的繁殖速度非常慢，這表明circHIPK3的缺失損害了發育。這些數據表明，circHIPK3缺失導致心臟早期衰老和心功能障礙（圖2）。
 

circHIPK3的敲除誘導小鼠心臟衰老^[4]

3.circHIPK3調控HuR蛋白表達
為了了解為什么circHIPK3缺失會導致p21上調，研究者通過circRNA相互作用網站（https://circinteractome.nia.nih.gov/）分析了circHIPK3可能的靶蛋白。分析沒有發現p21或p16是circHIPK3的靶點，但是在人源中發現HuR和circHIPK3之間有三個結合位點。隨后RPISeq分析（http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq）證實circHIPK3在小鼠中與HuR結合，且HuR蛋白在人和小鼠之間高度保守^[2]。通過PPI數據庫（https://www.string-db.org/）分析發現，HuR通過調節SIRT1、細胞周期相關蛋白和端粒長度參與衰老的發展，這表明HuR蛋白可能直接參與衰老過程。重要的是，HuR與p21 mRNA 3'-UTR區域的ARE結合，增加其穩定性，最終導致p21蛋白在細胞質中的表達增強（圖3）。
 

circHIPK3調控HuR蛋白表達^[4]

4.circHIPK3作為HuR和E3泛素連接酶的支架，促進HuR降解
前期研究表明，HuR可通過泛素-蛋白酶體途徑與E3泛素連接酶β-TrCP相互作用降解^[3]。事實上，在PPI數據庫中可以找到HuR與E3泛素連接酶β-TrCP之間的相互作用。研究者試圖用特定的蛋白酶體抑制劑MG132處理H9C2細胞，以阻止蛋白質通過蛋白酶體降解，以確定circHIPK3誘導的HuR蛋白下調是否由泛素-蛋白酶體系統介導。MG132處理增強了敲低circHIPK3誘導的HuR在細胞質中的積累，說明HuR被蛋白酶體降解，而敲低circHIPK3細胞中相對較高的HuR水平是由于抑制了HuR的降解。

RNA-pulldown同WB判定了circHIPK3和HuR之間的結合，RIP實驗和qRT-PCR再次驗證二者結合。這表明circHIPK3可能通過直接相互作用調節HuR的穩定性（圖4）。
 

circHIPK3作為HuR和E3泛素連接酶的支架，促進HuR降解^[4]

5.外泌體通過釋放circHIPK3來防止心肌細胞衰老
外泌體含有非編碼RNA，包括microRNA、lncRNA和circRNA。有研究表明，間充質來源的外泌體（UMSC-Exos）可抑制衰老引起的血管功能障礙和心功能障礙。研究者發現circHIPK3在外泌體中富集。外泌體circHIPK3處理可導致H9C2細胞中circHIPK3表達上調，并促進H9C2細胞增殖，抑制衰老，降低p16和p21的表達。不過，敲低circHIPK3可抑制外泌體對衰老的保護作用。這些結果表明了外泌體通過傳遞circHIPK3促進H9C2細胞增殖并抑制其衰老（圖5）。
 

外泌體通過釋放circHIPK3來防止CM衰老^[4]

研究結論
研究者發現了circHIPK3的缺失導致心肌細胞衰老加劇和心臟功能下降，circHIPK3作為支架增強了細胞質中E3泛素連接酶β-TrCP和HuR的結合，導致HuR的泛素化和降解，從而降低了衰老誘導因子p21活性。此外，間充質來源的外泌體通過遞送circHIPK3發揮了抗衰老和心臟保護作用。該研究提出了可用于研究心肌衰老的新動物模型，并在體內外進一步發掘了間充質來源的外泌體中環狀非編碼RNA在組織修復再生中的新機制，這些發現為心肌修復再生提供了新思路。
 

circHIPK3/HuR/p21在心臟早衰中的調控機制^[4]

參考文獻：
[1] Zheng Q, Bao C, Guo W, Li S, Chen J, Chen B, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016; 7: 11215.

[2] Sun Q, Tripathi V, Yoon JH, Singh DK, Hao Q, Min KW, et al. MIR100 host gene-encoded lncRNAs regulate cell cycle by modulating the interaction between HuR and its target mRNAs. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 10405-16.

[3] Lan Y, Xiao X, He Z, Luo Y, Wu C, Li L, et al. Long noncoding RNA OCC-1 suppresses cell growth through destabilizing HuR protein in colorectal cancer. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 5809-21.

[4] Fengzhi Ding, Lin Lu, Chengjie Wu, Xiangbin Pan, Bin Liu, Yu Zhang, Yanli Wang, Weiliang Wu, Bing Yan, Yuqing Zhang, Xi-Yong Yu, Yangxin Li, et al.Theranostics 2022; 12(17):7550-7566. doi:10.7150/thno.77630
 

Hipk3 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Hipk3^em1C/Cya
品系編號：
KOCMP-15259-Hipk3-B6J-VA
產品編號：
S-KO-02454
應用方向：
心血管系統,神經系統,細胞生物學,代謝研究,生理系統

打靶方案：

Hipk3 flox小 鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Hipk3^em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-15259-Hipk3-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-02894
應用方向：
心血管系統,神經系統,細胞生物學,代謝研究,生理系統

打靶方案：