各位老師好，本期為大家?guī)�來單�?xì)胞轉(zhuǎn)錄組標(biāo)準(zhǔn)分析之降維聚類。

單細(xì)胞研究的重點(diǎn)就是對細(xì)胞進(jìn)行分群和鑒定，然而單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)是一個高維的復(fù)雜數(shù)據(jù)陣列，通常涉及到龐大的細(xì)胞數(shù)量，以及每個細(xì)胞中的眾多基因。因此，面對復(fù)雜的數(shù)據(jù)陣列，在聚類之前，一般采用 PCA 方法進(jìn)行適度降維以降低計算量和噪音，然后用 Leiden 方法尋找降維空間中鄰近細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的模塊。最后，采用 tSNE 和 UMAP 兩種非線性降維方法分別對單細(xì)胞群聚類結(jié)果作可視化分析展示。

Q：如何進(jìn)行數(shù)據(jù)降維？
降維的過程其實(shí)就是去繁存簡，每個基因?qū)��?xì)胞來講都是一個變化維度。數(shù)據(jù)特征維度太高，不但計算很麻煩，其次特征之間可能存在相關(guān)的情況 ，從而增加了問題的復(fù)雜程度，分析起來也不方便，所以需要盡可能保證真實(shí)差異的前提下減少維度的數(shù)量，PCA就是合理的方式之一，既可以減少需要分析的特征，也盡可能多的保留原來的數(shù)據(jù)信息。
 
步驟一：尋找高變基因
降維的過程依賴于基因表達(dá)量，因此挑選那些更能代表整體差異的基因進(jìn)行降維分析是非常關(guān)鍵的，一般來說如果一個基因在細(xì)胞群體中變化幅度很大，它就是受關(guān)注對象，我們會認(rèn)為是生物因素導(dǎo)致了這么大的差異，該基因即為高度變化基因（highly variable genes ，HVGs）。
Seurat包FindVariableFeatures函數(shù)，會計算一個mean-variance結(jié)果，根據(jù)基因表達(dá)量方差和均值篩選，以此獲得高度可變的基因，一般默認(rèn)采用前2000個高變基因進(jìn)行后續(xù)降維分析。
 

高變基因示例圖
 

步驟二：降維
主成分分析 (PCA, principal component analysis)PCA的本質(zhì)是將n個特征減少到k個，保留那些對生物差異貢獻(xiàn)很大的特征。通過數(shù)據(jù)壓縮，減少后面分析會使用到的維度，減少分析難度的同時盡可能的保留原有數(shù)據(jù)的特征。
 
步驟三：選擇合適的PCs
利用Elbow Point進(jìn)行選擇。Elbow Point作圖后，一般選擇斜率平滑的點(diǎn)之前的所有PC軸，加起來差異累計過90%就可以接受，根據(jù)后面聚類的結(jié)果可以重復(fù)調(diào)整。每個PCs都能捕獲一些生物差異，而且前面的PC比后面的PC包含的差異信息更多，更有價值 。

細(xì)胞聚類目的是根據(jù)細(xì)胞中各個基因表達(dá)模式的相似性（或距離）將一組細(xì)胞劃分成具有生物學(xué)意義的亞群。Leiden算法是一種適用于scRNA-Seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行細(xì)胞聚類的算法。
 

Leiden聚類算法原理圖

Leiden算法從單例分區(qū)（a）開始。該算法將單個節(jié)點(diǎn)從一個社區(qū)移動到另一個社區(qū)，以找到合適的分區(qū)（b），然后對其進(jìn)行細(xì)化（c）。基于細(xì)化分區(qū)創(chuàng)建聚合網(wǎng)絡(luò)（d），使用非細(xì)化分區(qū)為聚合網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建初始分區(qū)。例如，（b）中的紅色社區(qū)被細(xì)化為（c）中的兩個子社區(qū)，在聚合之后，它們成為（d）中兩個獨(dú)立的節(jié)點(diǎn)，都屬于同一社區(qū)。然后，算法移動聚合網(wǎng)絡(luò)（e）中的各個節(jié)點(diǎn)。在這種情況下，細(xì)化不會改變分區(qū)（f）。重復(fù)這些步驟，直到無法進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)。
 
聚類之后的可視化，目前主要有tSNE和UMAP。兩者都是在高維空間中尋找保持相鄰關(guān)系的低維表示方法。
 
Q：tSNE和UMAP的區(qū)別？怎么選擇？
一是計算高維距離時，tSNE會計算所有點(diǎn)之間的距離，通過Perplexity（困惑度）參數(shù)調(diào)整全局結(jié)構(gòu)與局部結(jié)構(gòu)間的軟邊界，而UMAP則只計算各點(diǎn)與最近k個點(diǎn)之間的距離，嚴(yán)格限制局部的范圍；另一方面，兩種算法在對信息損失的計算方法不同，tSNE使用KL散度衡量信息損失，在全局結(jié)構(gòu)上存在失真的可能，而UMAP使用二元交叉熵，全局和局部結(jié)構(gòu)均有保留。目前兩種方法在文獻(xiàn)中均有使用，可根據(jù)實(shí)際情況來進(jìn)行選擇。
 
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