在全球范圍內(nèi)，食道癌是第七大常見癌癥。食管癌由兩種主要的組織學(xué)類型組成，包括食管鱗狀細胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。ESCC發(fā)生的重要危險因素包括飲酒、吸煙、高淀粉飲食等，但具體機制尚不清楚。
 

腫瘤微環(huán)境（TME）可以促進腫瘤進展。TME包括各種基質(zhì)細胞，例如癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAFs），腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）、其他非惡性細胞，和細胞外成分（細胞因子、生長因子、細胞外基質(zhì)等）。CAFs通過介導(dǎo)腫瘤增殖、遷移和侵襲的激活，以及誘導(dǎo)血管生成、刺激轉(zhuǎn)移等在腫瘤進展中起關(guān)鍵作用。CAFs可能來源于骨髓源性間充質(zhì)干細胞（MSCs）、常駐成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞和上皮細胞。α-平滑肌肌動蛋白（αSMA）和成纖維細胞活化蛋白（FAP）是CAFs的代表性細胞標志物，其表達升高與幾種癌癥的預(yù)后較差有關(guān)。研究表明，CAFs通過與TME的其他基質(zhì)成分（如TAMs）相互作用間接促進腫瘤進展。
 

在日本神戶大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科團隊先前的一項研究中，表征了ESCC中CAFs的腫瘤促進能力和免疫抑制表型的機制。此外，在MSCs和ESCC細胞之間進行共培養(yǎng)測定，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的MSCs中FAP表達增加。這些FAP陽性MSCs，實驗將其定義為CAF樣細胞，通過分泌C-C基序趨化因子配體2（CCL2）和白細胞介素-6（IL-6）來促進ESCC細胞和巨噬細胞的遷移能力，并誘導(dǎo)巨噬細胞的M2極化。然而，CAFs、M2極化巨噬細胞（所謂的TAMs）和ESCC細胞之間的相互作用尚未詳細闡明。

為了探索CAFs增強ESCC進展的機制，該團隊在體外通過將MSCs與ESCC細胞共培養(yǎng)來建立CAF樣細胞，通過cDNA微陣列分析比較了單培養(yǎng)MSCs和CAF樣細胞之間的基因表達譜，并表征了CAF樣細胞對ESCC細胞和巨噬細胞的影響。此外，確定了ESCC微環(huán)境中CAF樣細胞促進腫瘤作用的可能關(guān)鍵參與者，這些細胞可能被用作ESCC治療的潛在靶點。

MSCs 和CAF樣細胞對PAI-1的表達
 

通過間接共培養(yǎng)法評估CAFs在ESCC微環(huán)境中的功能（圖1 a）。在與三種TE-系列ESCC細胞：TE-8、TE-9、TE15細胞共培養(yǎng)的MSCs中誘導(dǎo)FAP的mRNA和蛋白表達水平。接下來將與TE-8、TE-9和TE-15細胞共培養(yǎng)的MSCs分別定義為CAF樣細胞：CAF8、CAF9和CAF15細胞（圖1 a）。通過比較單培養(yǎng)MSCs和CAF樣細胞的基因表達譜，在CAF9中確定了110個上調(diào)的基因和128個下調(diào)的基因。熱圖顯示了CAF9中上調(diào)基因中高表達的前50個基因（圖1 b）。不同細胞組中CAF9和CAF15的基因表達模式最為相似。單培養(yǎng)的MSCs具有與CAF樣細胞不同的表達模式。

在這項研究中，重點研究了絲氨酸蛋白酶抑制劑E1（SERPINE1），這是CAF樣細胞中上調(diào)且高表達的基因之一（圖1 b）。通過qRT-PCR證實了SERPINE1 mRNA以及IL6、CCL2和CXCL12 mRNA在CAF樣細胞中的高表達水平（圖1 c）。CAF樣細胞分泌的PAI-1（纖溶酶原激活物抑制劑-1，由SERPINE1編碼）的濃度明顯高于單培養(yǎng)的MSCs（圖1 d）。ELISA的結(jié)果驗證了ESCC細胞，特別是TE-8和TE-9細胞中PAI-1的分泌（圖1 d）。

圖1   PAI-1在CAF樣細胞中被誘導(dǎo)表達和分泌

針對PAI-1的中和抗體抑制CAF樣細胞誘導(dǎo)的ESCC細胞遷移

與CAF樣細胞CAF8、CAF9和CAF15細胞共培養(yǎng)，分別顯著誘導(dǎo)了3種TE-系列ESCC細胞TE-8、TE-9和TE-15細胞的遷移和侵襲能力（圖2 a、b）。添加針對PAI-1的中和抗體顯著抑制了與CAF樣細胞共培養(yǎng)的ESCC細胞的遷移和侵襲能力（圖2 c、d）。

圖2   CAF樣細胞分泌的PAI-1促進ESCC細胞的遷移和侵襲

PAI-1通過激活A(yù)kt和Erk1/2信號通路誘導(dǎo)ESCC細胞的遷移和侵襲

使用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法確認了PAI-1受體LRP1在三個TE-系列ESCC細胞中的表達（圖3 a、b）。為了研究PAI-1對ESCC細胞表型和信號通路的影響，將rhPAI-1應(yīng)用于TE-8、TE-9和TE-15細胞。rhPAI-1顯著促進了ESCC細胞的遷移和侵襲能力（圖3 c、d）。此外，rhPAI-1促進TE-8和TE-9細胞的遷移。rhPAI-1在處理10或30分鐘后增加p-Akt（Ser473 / Thr308）和p-Erk1/2水平（圖3 e）。PI3K抑制劑LY294002和MEK1/2抑制劑PD98059抑制了rhPAI-1處理的ESCC細胞中遷移和侵襲的誘導(dǎo)（圖3 f、g）。

圖3   PAI-1通過激活A(yù)kt和Erk1/2信號通路促進 ESCC 細胞的遷移和侵襲

PAI-1促進ESCC細胞的遷移和侵襲，并通過LRP1激活信號通路

為了闡明PAI-1是否通過LRP1影響ESCC細胞的表型和信號傳導(dǎo)，實驗通過RNA干擾抑制了三個TE-系列ESCC細胞中的LRP1 mRNA。結(jié)果表明，敲低ESCC細胞中LRP1顯著抑制了rhPAI-1誘導(dǎo)的遷移和侵襲。在ESCC細胞中LRP1敲低后，p-Akt和p-Erk1/2水平降低。

PAI-1通過LRP1激活A(yù)kt和Erk1/2信號通路誘導(dǎo)巨噬細胞的遷移和侵襲

實驗通過與上述相同的方法證實了PAI-1對巨噬細胞的影響。與CAF樣細胞共培養(yǎng)顯著誘導(dǎo)巨噬細胞的遷移和侵襲。針對PAI-1的中和抗體顯著抑制了CAF樣細胞誘導(dǎo)的巨噬細胞遷移和侵襲。使用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡證實了LRP1在巨噬細胞中的表達。研究發(fā)現(xiàn)rhPAI-1顯著促進了巨噬細胞的遷移和侵襲能力，觀察到rhPAI-1在處理10分鐘后增加了巨噬細胞中的p-Akt和p-Erk1/2水平。然而，rhPAI-1不影響巨噬細胞的M2極化。LY294002和PD98059抑制了rhPAI-1誘導(dǎo)的巨噬細胞遷移和侵襲能力。接下來，通過RNA干擾抑制巨噬細胞中的LRP1 mRNA，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞中LRP1的敲低抑制了rhPAI-1誘導(dǎo)的遷移和侵襲。PAI-1誘導(dǎo)的p-Akt和p-Erk1/2的水平也因巨噬細胞中LRP1的敲低而降低。

PAI-1 和 LRP1 表達水平與 ESCC 患者的臨床病理因素和預(yù)后相關(guān)

為了明確PAI-1和LRP1的表達水平是否與ESCC患者的臨床病理因素相關(guān)，實驗對69例人ESCC組織中的PAI-1和LRP1進行了免疫組織化學(xué)分析。根據(jù)PAI-1在基質(zhì)細胞中的免疫反應(yīng)性和LRP1在癌細胞（CA）或基質(zhì)細胞（ST）中的免疫反應(yīng)性將ESCC組織分為高表達組和低表達組（圖4 a、b、c、d），并通過雙重免疫熒光確認包括CD204⁺ TAMs在內(nèi)的基質(zhì)細胞在人ESCC組織中表達LRP1（圖4 e）。研究發(fā)現(xiàn)PAI-1在腫瘤基質(zhì)中的高表達水平與腫瘤浸潤深度、αSMA和FAP的高表達水平以及大量浸潤的CD204⁺巨噬細胞密切相關(guān)。LRP1（CA）的高表達水平與FAP的高表達水平和大量浸潤的CD204⁺巨噬細胞顯著相關(guān)。LRP1（ST）的高表達水平與性別、腫瘤浸潤深度、αSMA和FAP的高表達水平以及大量浸潤的CD204⁺巨噬細胞顯著相關(guān)。

接下來，分析了PAI-1和LRP1表達的預(yù)后值。分析顯示，PAI-1和LRP1（ST）高表達水平的患者無病生存期（DFS）明顯較短，LRP1（CA）高表達水平的患者腫瘤特異性生存期（CSS）明顯較短。PAI-1、LRP1（CA）或LRP1（ST）表達對患者的總生存期沒有顯著影響。

接下來，根據(jù)PAI-1和LRP1（CA）免疫反應(yīng)性評分的組合將患者分為三組。PAI-1和LRP1（CA）均高表達的患者與PAI-1和LRP1（CA）均低表達的患者相比，DFS和CSS顯著縮短。與PAI-1和LRP1（CA）表達水平低的患者相比，PAI-1或LRP1（CA）高表達水平的患者DFS明顯較短。同樣，根據(jù)PAI-1和LRP1（ST）免疫反應(yīng)性評分的組合將患者分為三組。PAI-1和LRP1（ST）表達水平高的患者與PAI-1和LRP1（ST）表達水平低的患者相比，DFS和CSS表達水平明顯較短。此外，PAI-1和LRP1（ST）高表達水平的患者與PAI-1或LRP1（ST）低表達水平的患者相比，DFS明顯較短。

圖4   PAI-1和LRP1在人ESCC組織中的表達

總之，該研究證明了來源于CAFs的PAI-1通過與LRP1相互作用，通過Akt和Erk1/2的磷酸化促進了ESCC細胞和巨噬細胞的遷移和侵襲。CAFs 中的 PAI-1 是 ESCC 患者的潛在預(yù)后因素。因此，靶向PAI-1/LRP1軸可能是ESCC的一種治療方法。
 

參考文獻：Sakamoto H, Koma YI, Higashino N, Kodama T, Tanigawa K, Shimizu M, Fujikawa M, Nishio M, Shigeoka M, Kakeji Y, Yokozaki H. PAI-1 derived from cancer-associated fibroblasts in esophageal squamous cell carcinoma promotes the invasion of cancer cells and the migration of macrophages. Lab Invest. 2021 Mar;101(3):353-368. doi: 10.1038/s41374-020-00512-2. Epub 2020 Dec 12. PMID: 33311557; PMCID: PMC7892342.

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