在從事CAR-T細胞治療研發(fā)的路上，小賽也在打磨自己的「醫(yī)藥養(yǎng)成筆記」，把遇到過的問題都認真整理出來，同時，小賽也準備了「細胞治療完整解決方案」，包括了CAR分子的設(shè)計、慢病毒包裝、CAR-T細胞構(gòu)建、體外體內(nèi)殺傷驗證等多個重要環(huán)節(jié)，致力于為廣大研發(fā)人員的項目出謀劃策。掃碼即可免費領(lǐng)取電子版，快來一鍵獲取干貨吧！
 

「醫(yī)藥養(yǎng)成筆記」精選放送

——part1：「靶細胞的構(gòu)建」相關(guān)問題
 

Q1：選定適應(yīng)癥和靶點，卻缺乏合適的天然腫瘤細胞作為靶細胞，這種情況應(yīng)該怎么選擇靶細胞？
這種情況下可以選擇構(gòu)建相應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，細胞株種類的選擇上還是盡量和所研究的適應(yīng)癥一致，例如研究的適應(yīng)癥為肝癌，就可以選擇相應(yīng)的肝癌腫瘤細胞系來進行穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建，這樣構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞也可以用于下游的體內(nèi)抗腫瘤活性評價實驗。另外，如果僅做一些簡單的抗腫瘤活性評估和特異性驗證工作，也可以選擇293T和CHO-K1這一類比較常用的工具細胞，這類細胞易于被慢病毒感染，因此很容易獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，可以節(jié)省時間成本。

Q2：進行雙特異性CAR-T的相關(guān)研究，但缺少雙靶點共表達的細胞系，如何解決靶細胞的選擇問題以及驗證所構(gòu)建的CAR-T細胞的特異性問題？
為解決腫瘤細胞靶點抗原表達的異質(zhì)性以及CAR-T細胞治療過程中存在抗原逃逸問題，雙特異性CAR-T的研究也越來越多。在沒有適合的用于雙靶點CAR-T細胞研究的靶細胞的情況下，可以通過構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株來解決，用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的細胞需盡可能來源于所研究的適應(yīng)癥的腫瘤細胞。為研究雙特異性CAR-T細胞的功能，也可以構(gòu)建表達單抗原以及雙抗原的細胞株，這樣通過體外對這些細胞株的裂解作用，可以在一定程度上評估雙特異性CAR-T細胞的特異性。

Q3：如何解決穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株表面抗原丟失的問題：用CD20編碼慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞構(gòu)建了一株293T-CD20穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，但是在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)CD20的表達時高時低。
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株如果帶有真核抗性的話可以加入相應(yīng)的抗生素來維持，但抗生素的加入量需要進行優(yōu)化才能取得比較好的維持效果；如果不具有真核抗性，可以通過流式分選進行幾輪富集，這樣可能能夠解決穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞抗原丟失的問題；另外可以通過挑克隆的方式，篩選獲得抗原穩(wěn)定表達的細胞株。

Q4：做CAR-T細胞治療腫瘤方面相關(guān)的研究時，如何選擇合適的靶細胞來證明CAR-T細胞抗腫瘤效果的特異性？
可以選擇靶抗原表達和不表達的細胞株，然后用CAR-T和對照T分別殺傷這兩種細胞，依據(jù)殺傷結(jié)果來判斷CAR-T細胞的抗腫瘤效果是否具有特異性。

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