在生物醫學研究中，低背景成像是至關重要的。熒光成像不可避免地會出現光漂白和相對較高的自發熒光背景。近年來，余輝發光（afterglow luminescence）吸引了人們的注意力。余輝發光材料存儲了輻照的光能，在激發光停止后仍能持續發光。古代的夜光杯、夜明珠等便是由這種材料制成。

余輝發光能夠避開熒光成像的缺點，在體內無背景成像中具有廣闊的應用前景，有望成為活體成像的替代方案，應用于細胞追蹤、癌癥成像、血管可視化等。不過，現有余輝材料存在結構惰性，響應位點不足，這使得可激活余輝探針的設計變得相當困難。同時，余輝強度的衰減也影響人們準確定量分析物。

為此，湖南大學譚蔚泓院士、張曉兵教授、宋國勝教授領導的研究團隊提出一種比率余輝發光納米平臺，可用于定制各種可激活的余輝探針，并對特定分析物進行可靠的定量和分子成像。這項研究成果發表在《Nature Communications》雜志上。
 

研究材料和方法
在這項研究中，體外實驗使用了4T1和RAW264.7巨噬細胞，體內實驗則使用了Nos2^−/−小鼠和野生型小鼠（這兩種小鼠均購自賽業生物）。研究人員在制備出RAN1、RAN2和RAN3探針后，測定了熒光和余輝成像。在實驗過程中，他們使用了流式細胞分析、免疫熒光分析、細胞凋亡分析等。

技術路線
01比率余輝發光納米平臺的設計
02三種比率余輝探針的制備，分別響應NO、ONOO⁻和pH
03從多方面評估比率余輝探針的性能
04利用比率余輝探針進行活體成像
05利用比率余輝探針來評估巨噬細胞極化

研究結果
1.比率余輝發光納米平臺的設計
研究人員提出了一種基于余輝的能量轉移系統，稱為“余輝共振能量轉移”（ARET），它融合了FRET和余輝發光的優點。在ARET中，FRET的供體熒光團被余輝底物取代。在激光輻照后，余輝底物產生激發態中間體來存儲能量，之后能量被轉移到能量受體，在輻照停止后發出另一道余輝。因此，可通過兩次發光的自校準來實現比率余輝成像，有效解決余輝衰減帶來的問題。

基于這種ARET策略，作者隨后設計出一種通用的比率式余輝納米平臺（RAN）。它通過自組裝策略整合響應分子（NRM、ORM或PRM）、余輝底物（MEHPPV）、表面活性劑（F127）和余輝引發劑（TPP或BDP）來定制可激活的余輝探針，以實現生物目標的定量（圖1）。
 

圖1 基于ARET的比率余輝納米平臺的示意圖

2.多個比率余輝納米探針的設計
通過引入不同的響應分子作為能量受體，可輕松制備各種可激活的比率余輝納米探針。在概念驗證研究中，研究人員設計了一氧化氮（NO）響應性的納米探針RAN1，然后系統研究了它對NO的響應。正如預期的那樣，隨著NO濃度的增加，RAN1在600nm處的余輝發光（AF1）減弱，而在830nm處的余輝發光（AF2）增強，表現出RAN1對NO的響應，而且余輝比（AF2/AF1）與NO濃度呈線性相關。這些結果表明，RAN1是一種出色的納米探針，可用于NO的余輝成像，并具有高的靈敏度和特異性。

為了證明這個納米平臺的通用性，研究人員又開發出兩種納米探針RAN2和RAN3，來響應過氧亞硝基陰離子（ONOO⁻）和pH（圖2）。分析結果表明，基于ARET的策略也適用于ONOO⁻或pH的靈敏檢測和成像，這進一步證實了比率余輝納米平臺在開發余輝探針上的可行性和普適性。
 

圖2 余輝探針對不同分子的響應

值得注意的是，后續的實驗表明，這些比率余輝探針不僅可解決余輝強度的衰減問題，消除激光功率、輻照時間和曝光時間的干擾，而且還顯著提高了體內成像的可靠性和信噪比（約1200倍）。

3.利用比率余輝成像來評估巨噬細胞極化
為了驗證RAN1對NO成像的能力，研究人員在LPS誘導的肝損傷實驗中使用Nos2^−/−小鼠作為對照（該Nos2^−/−小鼠購自賽業生物）。對于WT小鼠，LPS的處理可顯著提高余輝強度比（AF2/AF1），表明LPS孵育的小鼠肝臟中的NO含量較高。但對于Nos2^−/−小鼠，LPS的處理并沒有引起AF2/AF1顯著增加，這是由于Nos2基因的敲除導致NO無法產生。由此可見，RAN1能夠通過比率余輝成像檢測活體小鼠的內源性NO。

在此基礎上，他們預計RAN1有潛力對RAW264.7巨噬細胞的極化進行成像。他們使用多種調節劑來誘導巨噬細胞極化，將腫瘤相關巨噬細胞（TAM）轉化為殺傷腫瘤的M1表型，從而影響內源性NO水平。實驗結果表明，使用比率余輝成像，RAN1能夠實時檢測巨噬細胞極化過程中的NO變化，作為評估極化程度的有效參數（圖3）。這種比率信號可作為無創預測因子來實時評估巨噬細胞介導的腫瘤免疫治療的效果。
 

圖3 巨噬細胞介導的免疫治療的余輝成像

研究結論
綜上，研究人員受到FRET的啟發，設計出一種通用的比率余輝納米平臺�；�于ARET的比率探針不僅克服了余輝強度的衰減，消除了其他因素的干擾，而且表現出更高的成像可靠性，可用于分析物的定量分析。未來，這種納米平臺有望應用于巨噬細胞介導的免疫療法的無創評估，或活體動物中免疫治療調節劑的高通量篩選。