新生SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元原代分離培養(yǎng)方法
實(shí)驗(yàn)方法
1. 多聚賴氨酸（Poly-D-Lysine）包被培養(yǎng)板的制備：原代分離進(jìn)行前一天，用PBS緩沖液配制終濃度為0.1mg/ml的多聚賴氨酸工作液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，于超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取1ml加入六孔板內(nèi)，確保覆蓋板底，靜置孵育30min后吸出（可回收反復(fù)使用2-3次），用無(wú)菌水清洗培養(yǎng)板，置于超凈臺(tái)內(nèi)晾干，照紫外過(guò)夜。
2. 次日，取出生24h以內(nèi)的SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min。
3. 棉球吸干乳鼠體表的乙醇，迅速斷頭，浸泡于冰冷的含有2%雙抗的PBS緩沖液中。
4. 剪開(kāi)顱骨，取出腦，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，逐個(gè)剝離大腦皮層并浸泡于冰冷的含有2%雙抗的D-HANKS液中。
5. 將剝離的皮層清洗兩遍，棄去液體，用眼科剪迅速將皮層剪碎至糜狀。
6. 加入2倍體積的木瓜酶（使用前用PBS稀釋至終濃度2mg/ml），放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20min，期間用移液管吹打1-2次使之分散。
7. 消化結(jié)束后，加入10倍體積的D-HANKS液，同時(shí)加入1mg/ml的DNA酶，吹打混勻。
8. 用100μm孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾懸液一次，移至新的15ml離心管內(nèi)，1000rpm離心5min。
9. 棄去上清，D-HANKS液重懸細(xì)胞，吹打使之分散，并用70μm細(xì)胞篩過(guò)濾一遍，轉(zhuǎn)移至新的離心管，再次1000rpm離心5min。
10. 棄去上清，用含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×105/ml鋪于多聚賴氨酸包被的六孔板中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
11. 4h后換液，棄去培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞，并用PBS輕輕沖洗一遍，加入新鮮的含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)沒(méi)3天換液。
12. 一周后神經(jīng)元完全展開(kāi)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。
結(jié)果與分析
細(xì)胞培養(yǎng)效果
1. 多聚賴氨酸（Poly-D-Lysine）包被培養(yǎng)板的制備：原代分離進(jìn)行前一天，用PBS緩沖液配制終濃度為0.1mg/ml的多聚賴氨酸工作液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，于超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取1ml加入六孔板內(nèi)，確保覆蓋板底，靜置孵育30min后吸出（可回收反復(fù)使用2-3次），用無(wú)菌水清洗培養(yǎng)板，置于超凈臺(tái)內(nèi)晾干，照紫外過(guò)夜。
2. 次日，取出生24h以內(nèi)的SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min。
3. 棉球吸干乳鼠體表的乙醇，迅速斷頭，浸泡于冰冷的含有2%雙抗的PBS緩沖液中。
4. 剪開(kāi)顱骨，取出腦，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，逐個(gè)剝離大腦皮層并浸泡于冰冷的含有2%雙抗的D-HANKS液中。
5. 將剝離的皮層清洗兩遍，棄去液體，用眼科剪迅速將皮層剪碎至糜狀。
6. 加入2倍體積的木瓜酶（使用前用PBS稀釋至終濃度2mg/ml），放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20min，期間用移液管吹打1-2次使之分散。
7. 消化結(jié)束后，加入10倍體積的D-HANKS液，同時(shí)加入1mg/ml的DNA酶，吹打混勻。
8. 用100μm孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾懸液一次，移至新的15ml離心管內(nèi)，1000rpm離心5min。
9. 棄去上清，D-HANKS液重懸細(xì)胞，吹打使之分散，并用70μm細(xì)胞篩過(guò)濾一遍，轉(zhuǎn)移至新的離心管，再次1000rpm離心5min。
10. 棄去上清，用含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×105/ml鋪于多聚賴氨酸包被的六孔板中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
11. 4h后換液，棄去培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞，并用PBS輕輕沖洗一遍，加入新鮮的含有1%GLUT-MAX和2% B-27的Neurobasl-A培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)沒(méi)3天換液。
12. 一周后神經(jīng)元完全展開(kāi)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。
結(jié)果與分析
取材&分離操作
細(xì)胞培養(yǎng)效果
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