一、細胞簡介：

　　細胞名稱：TC-1小鼠肺上皮細胞

　　平臺編號:zl-056881

　　二．細胞的培養

　　1）準備1640培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

　　2）培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

　　三、細胞處理：

　　1）凍存細胞的復蘇：

　　將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

　　2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

　　對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

　　1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

　　3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

　　3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

　　四、應用

　　用于熊果酸誘導TC-1癌細胞自噬性死亡中線粒體相關機制的探討研究

　　探討線粒體在熊果酸誘導TC-1癌細胞自噬相關性死亡中的作用。

　　方法：利用細胞培養技術，熊果酸實驗濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM，作用TC-1細胞24小時后，普通光鏡下觀察細胞數目及形態的變化；各種濃度熊果酸分別作用1、2、3、4、5天后，采用MTT法檢測熊果酸對TC-1癌細胞增殖抑制作用；

　　利用流式細胞術檢測線粒體膜跨電位及細胞內ATP和ROS水平變化；分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復合物I、II、III和IV的活性；熊果酸30μM作用TC-1細胞6小時后，在透射電鏡下檢測線粒體形態變化；熒光顯微鏡下觀察線粒體與自噬標志蛋白LC3的位置關系。

　　結果光鏡下可見熊果酸作用24小時，10μM濃度組的細胞形態沒有明顯改變，而20μM或30μM組的細胞變圓，貼壁松散，分布稀疏，及細胞兩極出現黑色小點，出現不同程度的細胞死亡；

　　MTT實驗結果顯示熊果酸對TC-1癌細胞有顯著的增值抑制作用，并呈時間、劑量依賴，尤其是作用3天后，各組抑制率均達90%以上（P＜0．05）；當熊果酸作用24小時，陰性象限熒光占總熒光的比例分別為3.1%、3.8%、6.4%、24.7%，陰性象限比例越大線粒體膜跨電位（Δψm）越低，表明Δψm隨著熊果酸作用濃度升高而降低，UA30μM組Δψm降低尤其顯著（P＜0．05）；

　　線粒體呼吸鏈復合物I、II、III和IV的活性經熊果酸作用24小時均出現明顯抑制，尤其是復合酶IV（P＜0．05）；經熊果酸作用24小時，10μM組即出現細胞內ATP水平顯著降低；

　　熊果酸30μM分別作用0、4、8、12、24小時，細胞內ATP水平隨作用時間延長逐漸降低，呈時間依賴，并且作用4小時，與對照比ATP水平降低超過50%，12小時后，ATP水平接近0nmol/mg/protein（P＜0．05）；細胞內ROS的水平也隨熊果酸作用濃度升高而顯著降低，熊果酸作用24小時細胞內ROS陽性率分別是86.46%、82.52%、69.35%、57.24%（P＜0．05）。