人大細胞肺癌細胞的應用！
一、背景
NCI-H460人大細胞肺癌細胞是從一位大細胞肺癌患者的胸水中建立的。NCI-H460細胞表達的p53 mRNA易于檢測，水平與正常肺細胞相當，未表現出NCI-H460細胞DNA總體結構異常。NCI-H460細胞角蛋白和波形蛋白纖維染色陽性；神經絲三聯體蛋白陰性。
二、培養步驟
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。棄培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數量加入到凍存液中。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。
三、應用
用于尼古丁對NCI-H1975和NCI-H460細胞促進增殖作用及對PI3K/Akt通路的影響研究：
探討尼古丁對不同病理來源NSCLCs作用差異和可能機制,為建立尋找針對不同病理類型NSCLCs治療提供理論依據。方法:分別利用CCK-8細胞毒性試劑盒及流式細胞術檢測尼古丁對人肺腺癌細胞NCI-H1975和人大細胞肺癌細胞NCI-H460的促進增殖和抑制凋亡作用。利用Western blot和RT-PCR技術檢測尼古丁作用后NCI-H1975和NCI-H460細胞PI3K/Akt通路關鍵基因m RNA及蛋白表達的改變,建立尼古丁對不同病理類型NSCLCs細胞作用產生差異的分子機制。
結果：
1、CCK-8檢測結果顯示尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細胞均有促進增殖的作用,與對照組具有統計學意義（P<0.05）,具有時間依賴性（NCI-H1975,y=102.5e0.056x,R2=0.982;NCI-H460,y=102.5e0.056x,R2=0.976）及劑量依賴性（NCI-H1975,y=11.72ln（X）+100.4,R2=0.994;NCI-H460,y=10.90ln（x）+99.68,R2=0.996）,但NCI-H1975對尼古丁反應更迅速,更敏感,變化更大。
2、流式細胞術檢測結果顯示尼古丁能顯著降低順鉑導致的NCI-H1975、NCI-H460細胞凋亡（P<0.05）,具有時間依賴性（NCI-H1975,y=66.48x0.84,R2=0.979;NCI-H460,y=63.98x0.84,R2=0.985）,但NCI-H1975對尼古丁反應更迅速,更敏感,變化更大。
3、Western blot及RT-PCR檢測結果顯示尼古丁干預后隨尼古丁濃度增大NCI-H1975細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Caspase 9/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁濃度增大NCI-H1975細胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-Caspase9/p-Fox O3a/p-m TOR蛋白表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達下降;隨尼古丁作用時間增加NCI-H1975細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁作用時間增加NCI-H1975細胞PI3K蛋白表達增加、Bad/Caspase9/Fox O3a/m TOR表達下降。尼古丁干預后隨尼古丁濃度增大NCI-H460細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁濃度增大NCI-H460細胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-m TOR蛋白表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達下降;隨尼古丁作用時間增加NCI-H460細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁作用時間增加NCI-H460細胞PI3K蛋白表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達下降。
4、尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細胞Caspase 9和Fox O3a兩蛋白作用出現差異。
結論：
1、尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細胞有促進增殖和抑制凋亡作用,且作用具有劑量依賴性和時間依賴性。
2、NCI-H1975和NCI-H460細胞對尼古丁反應不同。
3、尼古丁可能通過調節PI3K/Akt通路下游Bad、Caspase 9、Fox O3a、m TOR基因表達水平及磷酸化水平來調節NCI-H1975和NCI-H460細胞增殖與凋亡。
NCI-H460人大細胞肺癌細胞是從一位大細胞肺癌患者的胸水中建立的。NCI-H460細胞表達的p53 mRNA易于檢測，水平與正常肺細胞相當，未表現出NCI-H460細胞DNA總體結構異常。NCI-H460細胞角蛋白和波形蛋白纖維染色陽性；神經絲三聯體蛋白陰性。
二、培養步驟
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。棄培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數量加入到凍存液中。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。
三、應用
用于尼古丁對NCI-H1975和NCI-H460細胞促進增殖作用及對PI3K/Akt通路的影響研究：
探討尼古丁對不同病理來源NSCLCs作用差異和可能機制,為建立尋找針對不同病理類型NSCLCs治療提供理論依據。方法:分別利用CCK-8細胞毒性試劑盒及流式細胞術檢測尼古丁對人肺腺癌細胞NCI-H1975和人大細胞肺癌細胞NCI-H460的促進增殖和抑制凋亡作用。利用Western blot和RT-PCR技術檢測尼古丁作用后NCI-H1975和NCI-H460細胞PI3K/Akt通路關鍵基因m RNA及蛋白表達的改變,建立尼古丁對不同病理類型NSCLCs細胞作用產生差異的分子機制。
結果：
1、CCK-8檢測結果顯示尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細胞均有促進增殖的作用,與對照組具有統計學意義（P<0.05）,具有時間依賴性（NCI-H1975,y=102.5e0.056x,R2=0.982;NCI-H460,y=102.5e0.056x,R2=0.976）及劑量依賴性（NCI-H1975,y=11.72ln（X）+100.4,R2=0.994;NCI-H460,y=10.90ln（x）+99.68,R2=0.996）,但NCI-H1975對尼古丁反應更迅速,更敏感,變化更大。
2、流式細胞術檢測結果顯示尼古丁能顯著降低順鉑導致的NCI-H1975、NCI-H460細胞凋亡（P<0.05）,具有時間依賴性（NCI-H1975,y=66.48x0.84,R2=0.979;NCI-H460,y=63.98x0.84,R2=0.985）,但NCI-H1975對尼古丁反應更迅速,更敏感,變化更大。
3、Western blot及RT-PCR檢測結果顯示尼古丁干預后隨尼古丁濃度增大NCI-H1975細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Caspase 9/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁濃度增大NCI-H1975細胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-Caspase9/p-Fox O3a/p-m TOR蛋白表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達下降;隨尼古丁作用時間增加NCI-H1975細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁作用時間增加NCI-H1975細胞PI3K蛋白表達增加、Bad/Caspase9/Fox O3a/m TOR表達下降。尼古丁干預后隨尼古丁濃度增大NCI-H460細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁濃度增大NCI-H460細胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-m TOR蛋白表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達下降;隨尼古丁作用時間增加NCI-H460細胞PI3K m RNA表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達下降,隨尼古丁作用時間增加NCI-H460細胞PI3K蛋白表達增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達下降。
4、尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細胞Caspase 9和Fox O3a兩蛋白作用出現差異。
結論：
1、尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細胞有促進增殖和抑制凋亡作用,且作用具有劑量依賴性和時間依賴性。
2、NCI-H1975和NCI-H460細胞對尼古丁反應不同。
3、尼古丁可能通過調節PI3K/Akt通路下游Bad、Caspase 9、Fox O3a、m TOR基因表達水平及磷酸化水平來調節NCI-H1975和NCI-H460細胞增殖與凋亡。
標簽：
NCI-H460細胞
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