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一文攬盡:熒光定量PCR擴增曲線哪個階段最重要

瀏覽次數:6814 發布日期:2021-11-17  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

qPCR擴增曲線一般分成四個階段:基線期、指數期、線性期和平臺期。那么每個階段PCR產物量的變化都有什么區別呢?哪個階段最重要呢?小編這就一一道來。

基線期

PCR起始時,剛開始前幾個循環的熒光信號還沒有發生變化,接近一條直線,將其稱之為基線,一般是3-15個循環。在基線期內,擴增的熒光信號被背景熒光信號所掩蓋,無法判斷PCR產物量的變化。

指數期

擴增的熒光信號高于背景熒光信號,擴增曲線起峰,開始進入指數期。在指數期內,每個循環積聚的產物準確加倍(假定100%反應效率)。該階段的PCR反應具有高度特異性和精確度。因為所有試劑均充足,反應的動力學推動反應有利于擴增子加倍,所以產物出現指數級擴增。只有在這個階段,Cq值與初始模板量的對數之間存在線性關系,所以在此階段進行定量分析最合適。

線性期(高變異性)

隨著PCR反應體系各成分的消耗,其中的一種或者多種成分限制反應,導致反應開始減緩,并且每個循環的PCR產物不再加倍,該階段不再是指數級擴增。

平臺期

反應停止,不再產生更多產物,并且如果放置時間夠長,PCR產物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應動力學,所以每支試管或每個反應將在不同的時間點進入平臺期,最終的產物含量也各不相同。

由于線性期和平臺期的擴增產物已不再呈指數級的增加,PCR的產物量與初始模板量之間沒有線性關系,所以也不能通過這兩個階段的PCR產物量計算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少,還要依賴指數期的Cq值進行計算。

▲ 圖1. qPCR 反應的重要階段
 

如圖所示,標準的擴增曲線是呈現S型的。曲線是否符合標準,不僅跟樣本起始量、qPCR體系配制、反應程序等相關,更依賴于一套高品質的實時熒光定量PCR系統。對于實時熒光定量PCR系統來說,高度檢測靈敏度、高度重復性和高度穩定性,是每一臺qPCR儀的追求。

高性能的Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統完全符合以上要求,該系統來自美國Azure Biosystems公司,融合了高品質的帕爾特溫度模塊和基于光纖傳輸的光學檢測系統,為您的科學研究提供高精準、高靈敏可靠結果。提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道,可根據實驗需求靈活配置。

同時配有10.3”觸控系統,主機本身可獨立運行、連接、遠程交互,讓您隨時隨地知悉實驗進程和及時獲得實驗結果。

▲ 圖2. Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統

高度的靈敏度

使用探針法,同時在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統和其他品牌產品上檢測GAPDH基因,結果表明:A)Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統對單拷貝基因的檢出率更高。B)Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的Cq平均值要低于2個Cq。

▲ 圖3. 單拷貝基因檢測對比(n=96)

高度的重復性

源于優異的孔間均一性。105拷貝數GAPDH模板,GAPDH引物擴增,96孔重復結果。Cq平均值=19.1,變異系數(Cv)=0.002。

▲ 圖4. 96孔重復擴增曲線   A)線性圖  B)對數圖

高度的穩定性

穩定可靠的溫度模塊和光學系統,確保儀器連續運行1000輪qPCR實驗,數據依然穩定可靠,重復性高度一致。對GAPDH進行檢測并連續計算Cq值得出平均值和Cq值的標準偏差。Cq值=22.4+0.01。

▲ 圖5. 長時間連續工作數據穩定

發布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
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