ROX是一種廣泛使用的惰性熒光染料，通常添加到qPCR反應液中以校正熒光信號。然而，隨著熒光技術在儀器中的發展，比如在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統，為了標準化而單獨使用染料的步驟已不再需要。當實時熒光定量PCR系統首次引入市場時，許多產品使用固定光源和檢測系統對96孔整板進行同時成像，導致熱塊中每個孔的光路不同（圖1）。光程差異將導致每個孔的絕對熒光測量值發生變化，這取決于它們在板上的位置。例如，具有較短光程的孔可能比具有較長光程的孔具有更高的熒光讀數，從而導致兩孔之間的熒光值偏差增大。因此，許多研究者開始使用參考染料（如ROX）對這種信號變化進行標準化校正。
 

Azure Cielo™實時熒光定量PCR的光學系統

由圖1可知，在傳統實時PCR系統的全板成像中，與角落的孔相比，中心區域的孔可以檢測到更高的熒光信號。由于ROX信號不受qPCR反應的影響，只要qPCR混合液的屬性保持不變，那么它在整個qPCR過程中也會保持穩定。基于這個原因以及ROX更優越的光譜特性，ROX被視為一個很好的參考染料，可用于熒光信號的歸一化處理，以校準光程差引起的熒光變化。但是ROX作為參考染料的挑戰在于，它占用了一個可能用于檢測靶標的熒光通道。隨著流感病毒和COVID-19新冠病毒（參照ANDiS SARS-CoV-2 and Influenza A/B RT-qPCR Detection Kit）等應用變得越來越普遍，多重反應也越來越常規，這也說明了多通道檢測的重要性。

Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統采用新型的高性能光學系統，在qPCR實驗中無需ROX校準。該光學系統采用16組光纖單孔掃描設計，一根光纖用于高能LED激發，另一根用于光信號檢測，可16孔同時采集，確保數據采集的一致性（圖2）。此外采用“全孔檢測”技術，每個孔可采集大約100,000個數據點，檢測時取讀數的平均值，精準測定每個孔的熒光強度（圖3）。這種“全孔檢測”為每個采集時間點提供了比單孔掃描系統更具重現性和可靠性的數據，因為單孔掃描系統僅僅采集少量的數據點。

應用實例：

1、方法：

配制20µl反應體系，在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統進行10個重復孔的qPCR擴增。

2、結果與討論：

結果表明，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統能很好地檢測到每個qPCR擴增產物。由圖4可知，10個重復孔的擴增曲線高度一致，說明所有孔檢測到的信號均勻增加；計算得出Cq平均值為17.54，標準偏差低至0.02。Cq值的變異系數（CV）為0.13%，也反映了數據的高精準度。

光纖檢測系統與Marlow-Peltier溫度模塊相結合，在qPCR實驗中實現了孔間信號檢測的均勻性和加熱溫度的均勻性，并且由于每個樣品都是單孔激發和掃描，因此避免了背景信號的干擾。通過10個重復反應的低標準偏差和CV值進一步證明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統的產品特點，即可完全消除光程差，不需要使用ROX進行均一化處理，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統仍能獲得高精準度的可靠數據。

Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統

Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統來自于美國Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測通道，根據實驗需求靈活配置。這款產品采用了高能LED作為光源系統，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準。Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統可為您的科學研究提供高精準度、高靈敏度和高可靠性的實驗結果。