FluorCam多光譜熒光成像技術應用案例——氮素營養狀況評估
氮素是植物最重要的營養元素之一。傳統的氮素分析方法需要對葉片進行烘干消解處理，不但費時費力，還要使用大量對環境有污染的化學藥品，更重要的是難以對同一植株進行跟蹤檢測，在野外大田采樣測量也非常不方便。為了更加便捷準確地進行植物/作物氮素營養狀況評估，新型無損檢測技術無疑是必需的。
近日，Journal of Experimental Botany在線發表浙江大學題為“Optimal temporal-spatial fluorescence techniques for phenotyping nitrogen status in oilseed rape (Brassica napus L.)”的研究論文。
浙江大學的研究人員使用了三種熒光技術——OJIP快速葉綠素熒光動力學技術、脈沖調制式葉綠素熒光成像技術和多光譜熒光成像技術獲取了不同氮素處理下油菜不同生長時期以及不同葉位的熒光數據。通過對熒光信號數據的單因素方差分析和線性判別分析，闡明了不同氮素處理的油菜葉綠素熒光信號在不同生長時期的垂直分布狀態，從而揭示最佳的氮素診斷葉位、時期與熒光信號獲取技術。本研究首先在室內通過盆栽實驗展開相關研究，最后進行了田間實驗的驗證，進而確保了結果的準確性與可重復性。
圖1. 左：典型樣品的RGB成像；右：實驗設計流程
葉片氮素與植物的光合能力和葉綠素含量密切相關。OJIP與脈沖調制式葉綠素熒光技術獲得的相關參數直接反映植物的光合能力與電子傳遞鏈的生理變化。多光譜熒光技術測量的紅色熒光RF和近紅外熒光IrF則直接反映了葉綠素含量，之前的相關研究已經指出RF/IrF這一比率與葉綠素濃度成負相關。這就是使用這三種技術進行氮素檢測的理論基礎。
圖2. 左：相關葉綠素熒光參數；右：多光譜熒光RF/IrF成像圖
研究結果表明，在抽薹期，底層葉片的葉綠素熒光參數Fv/Fm（脈沖調制式葉綠素熒光技術）和PIABS（OJIP快速葉綠素熒光動力學技術）對油菜氮素狀況較為敏感，而頂葉的RF/IrF（多光譜熒光成像技術）在苗期早期敏感。在保證結果準確率的前提下，相比其他兩種技術，多光譜熒光成像技術有其獨特的優勢。首先，多光譜熒光成像在葉片頂部的敏感度最高且檢測的時間也最早；其次，相較于其他葉綠素熒光技術，多光譜熒光成像技術不需要暗適應，因此更適合用于田間冠層尺度的檢測。綜上，本研究推斷出多光譜熒光成像技術在油菜氮素水平的田間早期診斷中擁有較高潛力。本研究可為氮素施肥管理決策和高產品種選育提供理論和技術支持。
基于這三種技術，目前有可以進行成像測量和僅能進行點測量的兩類儀器。而對于類似研究來說，成像儀器無疑是具有巨大優勢的。本研究中脈沖調制式葉綠素熒光成像和多光譜熒光成像分析都是使用的FluorCam開放式多光譜成像系統。這一系統是目前國際上唯一可同時進行脈沖調制式葉綠素熒光成像、多光譜熒光成像和NDVI歸一化植被指數成像的儀器。而且其升級型號更可以增加OJIP快速葉綠素熒光成像功能。由于OJIP快速葉綠素熒光成像技術難度較大，FluorCam也是目前唯一能進行這一成像分析的儀器。因為條件限制，本研究中OJIP測量則只能使用具備這一功能的手持式葉綠素熒光儀進行葉片單點測量。
浙江大學使用FluorCam系統已經發表了近10篇SCI文獻。而在相關氮素營養研究中，Specim高光譜成像技術也是被廣泛應用的。浙江大學之前就使用這一技術研究了胡椒總氮的空間分布。高光譜成像技術與熒光成像技術結合則可以進行更加全面的植物營養表型研究。
參考文獻：
FluorPen手持儀葉綠素熒光儀
FluorCam葉綠素熒光成像系統
FluorCam多光譜熒光成像系統
Thermo-RGB紅外熱成像技術
SpectraPen/PolyPen、Specim高光譜測量技術
PhenoPlot®輕便型作物植物表型成像分析系統
PhenoTron-SR植物表型成像分析系統
PlantScreen植物高通量表型成像分析平臺
近日，Journal of Experimental Botany在線發表浙江大學題為“Optimal temporal-spatial fluorescence techniques for phenotyping nitrogen status in oilseed rape (Brassica napus L.)”的研究論文。
浙江大學的研究人員使用了三種熒光技術——OJIP快速葉綠素熒光動力學技術、脈沖調制式葉綠素熒光成像技術和多光譜熒光成像技術獲取了不同氮素處理下油菜不同生長時期以及不同葉位的熒光數據。通過對熒光信號數據的單因素方差分析和線性判別分析，闡明了不同氮素處理的油菜葉綠素熒光信號在不同生長時期的垂直分布狀態，從而揭示最佳的氮素診斷葉位、時期與熒光信號獲取技術。本研究首先在室內通過盆栽實驗展開相關研究，最后進行了田間實驗的驗證，進而確保了結果的準確性與可重復性。
圖1. 左：典型樣品的RGB成像；右：實驗設計流程葉片氮素與植物的光合能力和葉綠素含量密切相關。OJIP與脈沖調制式葉綠素熒光技術獲得的相關參數直接反映植物的光合能力與電子傳遞鏈的生理變化。多光譜熒光技術測量的紅色熒光RF和近紅外熒光IrF則直接反映了葉綠素含量，之前的相關研究已經指出RF/IrF這一比率與葉綠素濃度成負相關。這就是使用這三種技術進行氮素檢測的理論基礎。
圖2. 左：相關葉綠素熒光參數；右：多光譜熒光RF/IrF成像圖研究結果表明，在抽薹期，底層葉片的葉綠素熒光參數Fv/Fm（脈沖調制式葉綠素熒光技術）和PIABS（OJIP快速葉綠素熒光動力學技術）對油菜氮素狀況較為敏感，而頂葉的RF/IrF（多光譜熒光成像技術）在苗期早期敏感。在保證結果準確率的前提下，相比其他兩種技術，多光譜熒光成像技術有其獨特的優勢。首先，多光譜熒光成像在葉片頂部的敏感度最高且檢測的時間也最早；其次，相較于其他葉綠素熒光技術，多光譜熒光成像技術不需要暗適應，因此更適合用于田間冠層尺度的檢測。綜上，本研究推斷出多光譜熒光成像技術在油菜氮素水平的田間早期診斷中擁有較高潛力。本研究可為氮素施肥管理決策和高產品種選育提供理論和技術支持。
基于這三種技術，目前有可以進行成像測量和僅能進行點測量的兩類儀器。而對于類似研究來說，成像儀器無疑是具有巨大優勢的。本研究中脈沖調制式葉綠素熒光成像和多光譜熒光成像分析都是使用的FluorCam開放式多光譜成像系統。這一系統是目前國際上唯一可同時進行脈沖調制式葉綠素熒光成像、多光譜熒光成像和NDVI歸一化植被指數成像的儀器。而且其升級型號更可以增加OJIP快速葉綠素熒光成像功能。由于OJIP快速葉綠素熒光成像技術難度較大，FluorCam也是目前唯一能進行這一成像分析的儀器。因為條件限制，本研究中OJIP測量則只能使用具備這一功能的手持式葉綠素熒光儀進行葉片單點測量。
圖3. 左：FluorCam開放式多光譜成像系統；中：使用FluorCam系統進行的擬南芥OJIP快速葉綠素熒光成像分析；右：可同時進行OJIP與脈沖調制式葉綠素熒光測量的FluorPen手持式葉綠素熒光儀
浙江大學使用FluorCam系統已經發表了近10篇SCI文獻。而在相關氮素營養研究中，Specim高光譜成像技術也是被廣泛應用的。浙江大學之前就使用這一技術研究了胡椒總氮的空間分布。高光譜成像技術與熒光成像技術結合則可以進行更加全面的植物營養表型研究。
圖4. 左：Specim IQ智能高光譜成像儀；中：PhenoPlot輕便型光譜成像技術方案；右：浙江大學使用Specim技術進行的胡椒總氮空間分布研究
參考文獻：
- Sun D, et al. 2020. Optimal temporal–spatial fluorescence techniques for phenotyping nitrogen status in oilseed rape. Journal of Experimental Botany, doi:10.1093/jxb/eraa372
- Yu K Q, et al. 2014. Hyperspectral Imaging for Mapping of Total Nitrogen Spatial Distribution in Pepper Plant. PLoS ONE 9(12): e116205. doi:10.1371/journal.pone.0116205
FluorPen手持儀葉綠素熒光儀
FluorCam葉綠素熒光成像系統
FluorCam多光譜熒光成像系統
Thermo-RGB紅外熱成像技術
SpectraPen/PolyPen、Specim高光譜測量技術
PhenoPlot®輕便型作物植物表型成像分析系統
PhenoTron-SR植物表型成像分析系統
PlantScreen植物高通量表型成像分析平臺
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