Dispendix I-DOT非接觸式微量分液系統(tǒng)在qPCR樣品準備的應用

瀏覽次數(shù)：4106　發(fā)布日期：2020-9-23　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

實時熒光定量PCR

Real-time qPCR實驗是生命科學研究領(lǐng)域的一項必備技能。相比于常規(guī)的PCR實驗，real-time qPCR靈敏度高，重復性好，已經(jīng)被用于生命科學研究的各個領(lǐng)域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。它是對PCR擴增過程的實時監(jiān)測，在PCR擴增的指數(shù)期間，Ct值（qPCR中起始模板擴增達到一定產(chǎn)物量時所對應的循環(huán)數(shù)）和該模板的起始cDNA拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以Ct值成為特定基因定量的依據(jù)。

由于最終結(jié)果中1個Ct的差異將反映初始模板的2倍拷貝數(shù)的差異，因此為了減少實驗數(shù)據(jù)的偏差，通常要求實驗結(jié)果中同一樣本不同副孔的Ct值偏差越小越好，比如三副孔之間偏差小于0.3個Ct，甚至更低。為了實現(xiàn)這一目的，在qPCR實驗的全流程中，擴增樣品反應體系配制的精準度是非常重要的，它很大程度決定了后期實驗數(shù)據(jù)的準確性和可信度。

同時，由于基礎(chǔ)研究的效率提升，或者檢測類的指標組合較多，通常在一次qPCR實驗中，研究人員期望對多個cDNA模板進行多個基因的檢測，這些模板可能來自于不同種類的樣本，不同時間點的樣本。每個cDNA模板又同時需要檢測內(nèi)參基因。模板和引物的每個組合通常都會做3~4個副孔，這樣算下來，一次qPCR實驗至少要一塊96孔板或者384孔板，甚至更多板子。96孔板和384孔板中的qPCR反應體系常規(guī)設(shè)置為20ul和10ul，有時候為了節(jié)約試劑做更多的檢測指標，會將反應體系分別降低到10ul和5ul。

I-DOT助力qPCR樣品準備

那么針對如此復雜的實驗組合和小體積的qPCR樣品配制，傳統(tǒng)手動配制的方式，如下面的問題，你是否都遇到過？而這些問題，通過德國DispendiX公司的I-DOT非接觸式微量分液系統(tǒng)可以完全解決。

傳統(tǒng)手動配制方式 VS I-DOT自動配制方式

I-DOT qPCR操作流程詳解

我們以如下一個復雜的384孔的qPCR實驗為例，整板實驗包含了對8個cDNA模板進行16個引物對的檢測，每個組合設(shè)置了3個副孔的實驗。設(shè)定實驗總體積為10ul，其中含有DNA結(jié)合探針/染料的Master mix為5ul，cDNA模板3ul，引物2ul（此處為了簡化模擬實驗模型，將相對均勻地分配10ul體系的組合，實際情況中，會使用到更低體積的模板或者引物）。

01 排兵布陣

在軟件Target Layout中通過選擇、復制、移動的方式設(shè)置實驗孔在qPCR板中的分布圖，如上復雜的384實驗設(shè)置在5分鐘內(nèi)可完成，設(shè)置完成后，軟件記錄了每個孔需要使用到的Master mix的體積，模板的種類和體積，引物的種類和體積，并同步計算整塊384孔板所使用到的所有的液體種類和體積。無需任何人工計算。

02 自動分配

在軟件Source Layout中對照分布圖，使用移液器將對應的液體種類的對應體積加入到對應的96孔pure plate板（母液板）中

03 對號入座 & 模擬分配

將全新的qPCR板和已經(jīng)加入待分配液體的pure plate板放入I DOT機器中，在Overview界面檢查模板設(shè)置和進行模擬分配（模擬分配也可省略）

04 一鍵啟動

啟動液體分配工作，5~15分鐘完成自動分液工作。

05 分配完成 & 質(zhì)量監(jiān)控

I-DOT軟件的DropDetection功能可實時監(jiān)測分液過程中的每一滴液滴，以及液滴中的氣泡，這一簡單有力的工具確保了液滴的有效分配和實驗的最優(yōu)化。DropDetection通過嵌置在樣品板下方的電路板形成96個微小的光路屏障，檢測不同位置樣品孔中噴射出的液滴通過光路屏障時光強度的變化。在液體分配結(jié)束后，DropDetection可提供基于顏色編碼或文本的監(jiān)測數(shù)據(jù)。