做Western Blot的小伙伴，是不是還在為歸一化方法而糾結(jié)呢？今天小編就和大家匯總一下看家蛋白和總蛋白歸一化的方法。

看家蛋白歸一化

使用看家蛋白的最大缺點(diǎn)是在樣品間和不同條件下表達(dá)水平可能不一致。如使用看家蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，必須先花費(fèi)時(shí)間和精力來驗(yàn)證內(nèi)參的選擇。

使用看家蛋白的第二個(gè)重大挑戰(zhàn)是它們的表達(dá)豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達(dá)非常高，這會(huì)限制在凝膠上加載的樣品量，如果感興趣的蛋白不是同樣的表達(dá)豐度，那這兩種蛋白質(zhì)就不在同一線性檢測(cè)范圍內(nèi)。

如果您正在進(jìn)行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質(zhì)的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個(gè)挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復(fù)雜性。

最后，檢測(cè)的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測(cè)。理想情況下，看家蛋白應(yīng)該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。當(dāng)實(shí)驗(yàn)在同一印跡上檢查多種目的蛋白時(shí)，這就變得越來越困難。

總蛋白歸一化

使用總蛋白歸一化，是直接在膜上檢測(cè)總蛋白，并且該值在歸一化時(shí)用作分母。總蛋白染色提供更寬的動(dòng)態(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更精準(zhǔn)的定量數(shù)據(jù)。

與使用看家蛋白相比，圖像采集后的分析工作流程基本不變; 整個(gè)泳道或泳道中大部分信號(hào)用于歸一化，而不是單一的條帶。

例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊會(huì)推薦使用總蛋白歸一化方法。

使用總蛋白染色劑對(duì)膜進(jìn)行染色提供了質(zhì)控優(yōu)勢(shì)，可以驗(yàn)證轉(zhuǎn)印是否完全。

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