時間分辨熒光：

理論上，熒光是最靈敏的檢測手段，由于許多分子間和分子內的變化會改變標記物的熒光發射。因此，很早就把它作為均相分析技術可能的新的手段。而現在偏振，淬滅，時間關聯，熒光壽命改變以及熒光共振能量轉移（FRET）已經被廣泛應用在對分子間作用的研究中。

在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白質是自發熒光的，利用傳統的快速熒光基團進行檢測極大的限制了實驗靈敏度。使用長壽命的熒光基團結合時間分辨的檢測方式（在熒光激發和發射檢測之間有一個時間延遲）可將快速熒光的干擾降到最低。

時間分辨熒光（TRF）利用稀土元素中鑭系元素的獨特性質。再TRF中常用的鑭系元素是釤（Sm）、銪（Eu）、鋱（Tb）、鏑（Dy）。與傳統熒光基團相比，他們具有大的斯托克位移，和非常長的發射半衰期（從微妙到毫秒），這使它們在生物學熒光應用領域中日益重要。

通過直接激發使鑭系元素離子產生熒光是不容易的，因為這些離子很難吸收光子，鑭系元素必須首先與有機分子形成復合物，有機分子收集光子并通過分子內非放射性過程轉移到鑭系元素上。稀土元素螯合物和穴狀配合物是能量收集裝置的典型代表，他們收集能量并轉移到鑭系元素離子上，后者則發出其特征性的長壽命熒光。

為了能夠成功應用于生物學檢測中，稀土元素復合物應該具有特定的性質，包括穩定性。較高的發射光產率，并且能夠與生物分子進行連接。除此之外，當直接在生物溶液中進行反應時，能夠耐受熒光淬滅就顯得尤為重要。稀土元素螯合物穩定性較差，而且有的化合物可競爭螯合物活性基團，當與FRET技術結合在一起時其靈敏度也會收到限制。如果稀土元素與穴狀物結合，許多限制因素都可去除。

熒光共振能量轉移（FRET）：

熒光共振能量轉移是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團(供體 Donor)的發射光譜與另一個基團(受體 Acceptor)的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時(一般小于100Å)，就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象，即以前一種基團的激發波長激發時，可觀察到后一個基團發射的熒光。

在熒光共振能量轉移中，受體發射熒光的壽命等同于供體的發射熒光的壽命。因為Eu的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會誘導XL665受體長時間地發射熒光，受體激發后產生的熒光便能持續較長時間，這樣通過時間分辨就可以區分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區分出FRET信號。

當由于生物分子相互作用導致兩個熒光基團接近時，在激發時被穴狀化合物捕獲的部分能量釋放，發射波長為620nm；另一部分能量轉移到受體（acceptor）上，發射波長為 665nm。665nm的發射光僅僅由供體（donor）引起的FRET產生。所以，當生物分子相互作用時，有兩個激發光620nm和 665nm；當不存在相互作用時，只有620nm一個激發光。

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4.在〜350 nm處被普通光源最大程度地激發。

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時間分辨發光探針的典型受體： 

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