RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）
 
主要用途
 
 RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑是一種旨在通過使用RiboGreen熒光染料與樣品中RNA的高度結合而產生熒光信號來精確定量樣品中RNA含量的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種分子生物學實驗，例如體外轉錄RNA、Northern Bolt、S1核酸酶檢測、RNA酶保護檢測、cDNA庫制備、逆轉錄PCR和差異顯示PCR中RNA含量分析。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，高度敏感。
 
技術背景
 
作為RNA染色劑之一的RiboGreen熒光染料與樣品中RNA，包括rRNA、mRNA等結合，產生熒光信號。RiboGreen技術可以檢測到低達1納克RNA的變化。RNA的微量增加引起熒光信號強度（Intensity）或相對熒光單位（RFU）的顯著增加。其自發熒光（Autofluorescence）忽略不計，重復性標準差異（Standard Deviation）低，不受樣品化學成分的干擾。
 
產品內容
 
染色液（Reagent A）     15微升
稀釋液（Reagent B）      5毫升
標準液（Reagent C）         200微升
產品說明書                          1份
 
保存方式
 
保存染色液（Reagent A）和標準液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里，染色液（Reagent A）避免光照，有效保證6月
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
200微升1厘米光徑比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器
熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析
 
實驗步驟
 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品，置于冰槽里
• 設定好熒光分光光度儀：激發波長485±10nm，散發波長530±12.5nm，并置零
• 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置于冰槽里融化。然后移出500微升稀釋液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入2.5微升染色液（Reagent A），混勻后，用錫紙包裹，標記為染色工作液（5次測定量），放在暗室里。然后進行下列操作。

 

• 構建標準曲線

 

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入100微升稀釋液（Reagent B）到每個離心管
• 移取100微升標準液（Reagent C）到1號管，混勻
• 小心移取100微升1號管稀釋的標準液（Reagent C）到2號管，混勻
• 小心移取100微升2號管稀釋的標準液（Reagent C）到3號管，混勻
• 小心移取100微升3號管稀釋的標準液（Reagent C）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管含量見下表

 

管號	稀釋液（Reagent B）	標準液（Reagent C）	標準RNA總量
1	100微升	100微升	1微克/毫升
2	100微升	100微升1號管	0.5微克/毫升
3	100微升	100微升2號管	0.25微克/毫升
4	100微升	100微升3號管	0.125微克/毫升
5	100微升	空對照	0

 

• 移取100微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿
• 加入100微升上述配制的標準液
• 室溫下，孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光分光光度儀測讀：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復實驗步驟8至11四次
• 繪制標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RLU）；橫坐標（X軸）為DNA含量（微克/毫升）

 

• 樣品檢測

 

• 移取100微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液到新的比色皿
• 加入100微升待測樣品
• 室溫下，孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光分光光度儀測讀：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據標準曲線獲得樣品對應RNA含量（微克/毫升）

 
注意事項
 

• 本產品為25次操作，包括標準曲線測定
• 整個操作須帶手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
• 建議所有的操作用品屬于RNA專用
• 使用新鮮配制的染色工作液，務必不要超過2小時，且注意避光
• 孵育時，避免光照
• 系統檢測，標準曲線測定1次即可；如果儀器更換，則需要重新測定1次
• 如果熒光讀數過高，可以相應稀釋樣品量
• 鹽類、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白、瓊脂糖不會干擾檢測
• 如果樣品中含有DNA，建議使用5單位DNA酶，37℃孵育90分鐘預處理
• 標準曲線參考如下：

 

• 本公司提供系列RNA檢測試劑產品

 
質量標準
 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定高度敏感