常用蛋白質濃度測定方法匯總
常用蛋白質濃度測定方法匯總
蛋白質是細胞中最重要的含氮生物大分子之一，承擔著各種生物功能。蛋白質的定量分析是蛋白質構造分析的基礎。目前常用的蛋白測量的方法主要有BCA法、考馬斯亮藍法(Bradford)和Lowry法等。
BCA法
原理
在堿性環(huán)境下蛋白質與Cu2+絡合并將Cu2+還原成Cu1+(biuret reaction)。BCA與Cu1+結合形成穩(wěn)定的紫藍色復合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質濃度成正比，據此可測定蛋白質濃度。
實驗步驟
1.按試劑盒說明書配置BCA工作液；
2.完全溶解蛋白質標準品，加到96孔板的蛋白標準品孔中，按照說明書要求對標品進行梯度稀釋，加入BCA工作液，用酶標儀測定其吸光度；
3.以樣品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標準曲線；
4.待測樣品中加入BCA工作液，測定吸光度，帶入標準曲線中，計算樣品濃度。
與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點是不受去垢劑的影響。
考馬斯亮藍法(Bradford)法
原理
考馬斯亮藍G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌�，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。
實驗步驟
1.按試劑盒說明書配置Bradford染液；
2.完全溶解蛋白質標準品，加到96孔板的蛋白標準品孔中，按照說明書要求對標品進行梯度稀釋，加入染液和染料結合液后，用酶標儀測定其吸光度；
3.以標品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標準曲線；
4.各孔中加入染液和染料結合液，測定樣品吸光度，帶入標準曲線中，計算樣品濃度。
Bradford法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質。
斐林—酚試劑(Lowry)法
原理
斐林(Folin)-酚試劑法結合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質的反應，其中包括兩步反應：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質-銅絡合物;第二步是此絡合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍和磷鎢藍的深藍色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關，在650nm波長下有最大光吸收。
實驗步驟
與上述兩種方法大致相同
LORRY法靈敏度高,重復性好，適于5～l00μg蛋白質的定量，耗時長，操作要嚴格計時，在實驗中要特別注意排除還原物質、檸檬酸等的干擾作用才能得到最準確的實驗結果。
這幾種方法共同點在于，都需要繪制標準曲線，而標準曲線及待測樣品往往數量較多，為了縮短實驗耗時，保證測量準確性，可使用酶標儀對吸光度進行測定。
