使用MANTIS®液體處理器，解決了處理單細胞樣品特有的問題，提高了新工作流程的定量準確性

量化單個哺乳動物細胞中蛋白質(zhì)歷來依靠免疫抗體技術(shù)，如CyTOF、單細胞免疫印跡和鄰近延伸試驗。盡管有效，但這些方法在生產(chǎn)通量上受到限制，且它們的準確性可能由于缺乏高度特異性抗體而降低。此外，和任何用于研究細胞的免疫分析方法一樣，這些技術(shù)都面臨著與細胞通透性和表位可及性相關(guān)的挑戰(zhàn)。

為了解決這些問題，東北大學斯拉沃夫?qū)嶒炇业难芯咳藛T最近開發(fā)了單細胞蛋白質(zhì)組學質(zhì)譜 (SCoPE-MS)，這是一種使用同位素標記定量 (TMT)標記單細胞多肽的技術(shù)。通過在納米液相色譜分離之前將標記的肽與標記的載體肽混合， SCoPE-MS被證明可以極大地減少樣品損失——當處理低豐度材料時如單細胞時，這是一個關(guān)鍵的考慮因素。對小鼠胚胎干細胞分化中的1000多種蛋白質(zhì)進行定量分析，并將這些數(shù)據(jù)與mRNA表達進行比較，不僅為SCoPE-MS定 量表征單細胞基因調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，并且強調(diào)了它根據(jù)蛋白質(zhì)組對細胞進行分類的潛力。

隨著自動化和小型化樣品制備的引入2，SCoPE-MS已經(jīng)發(fā)展成為SCoPE2。除了提供更好的定量精度外，SCoPE 2有利于降低成本、減少操作時間，顯著提高樣品制備和測量的通量。MANTIS®液體處理器(圖1)是這一成功的關(guān)鍵，提供了可靠的亞微升容量分配，甚至是出了名難分配的液體，如用于存儲TMT的100%乙腈。

圖1：MANTIS®液體處理器

單細胞樣品處理的獨特挑戰(zhàn)

樣本低通量是單細胞研究人員面臨的主要問題。一個“正常”的哺乳動物細胞的蛋白質(zhì)組通常 只有50-500pg，質(zhì)量上限為廣泛使用的HeLa細胞系，而像單核細胞這樣的細胞含有較少的蛋白質(zhì)。因此，進行一項實驗需要將數(shù)十個、數(shù)百個甚至數(shù)千個樣品結(jié)合起來，以獲得足夠的數(shù)量進行分析。反之，這給并行樣本處理帶來了挑戰(zhàn)，必須確保將樣本損失降到最低，以避免時間、資源的浪費。

綜合處理這些問題的方法

斯拉沃夫?qū)嶒炇业难芯咳藛T已經(jīng)確定了幾種克服上述挑戰(zhàn)的方法。為了解決低樣品豐度的問題，設(shè)計了減少表面損失的措施，允許使用小體積樣品。細胞裂解方法的改變省去了在質(zhì)譜分析之前的清理步驟，這是現(xiàn)有質(zhì)譜方法中的一個關(guān)鍵步驟，通常會損失大量的蛋白質(zhì)。多孔板的使用有助于確保分析是可靠和穩(wěn)健的。最后，自動化的引入是消除人工樣本處理錯誤和增加通量的基礎(chǔ)。

SCoPE2工作流程

為了解MANTIS®液體處理器是如何運用于SCoPE2中，掌握SCoPE2工作流程是很重要的(圖2) 。下面展示的工作流總結(jié)，用橙色標出了使用MANTIS®液體處理器的階段。
 

SCoPE2 工作流程：

• 用1 μL含25 pmol Waters MassPREPTM（一種簡單的5肽混合物，有助于鈍化塑料制品）的純水制備384-孔板。

• 使用細胞分揀器將單個細胞分配到孔板中，以實現(xiàn)隨機布局(圖3)，并在-80°C冷凍孔板。

• 將孔板快速轉(zhuǎn)到PCR機上，并在90°C加熱10分鐘溶解細胞。

• 慢速旋轉(zhuǎn)孔板，冷卻，在水浴聲納器孵育5分鐘，然后再次旋轉(zhuǎn)。

• 每孔加入0.2 μL主混合液（00mM TEAB, 10ng /μL胰蛋白酶，0.25單位/μL苯并酮酶），將蛋白分解為多肽，37℃孵化3小時。

• 每孔加入0.5 μL 22 mM TMT（100%乙腈）標記多肽，室溫孵化1小時。

• 每孔加入0.2μL0.5％羥胺，淬滅任何未反應(yīng)的TMT，室溫孵化30分鐘。

• 使用多道移液管組合樣品，轉(zhuǎn)移到自動進樣器玻璃插入瓶中，集中干燥。

• 樣品重新懸浮于1.2 μL 0.1%甲酸溶液中，用于LC-MS/MS分析。

圖2：SSsc工作流。使用MANTIS®液體處理器進行的步驟以橙色顯示。

使用MANTIS®液體處理器提高了定量準確性

通過在原有的SCoPE-MS工作流程中引入自動化、小型化的樣品制備，斯拉沃夫?qū)嶒炇业难芯咳藛T獲益于顯著增加的實驗通量。使用SCoPE2，可在短短10天的儀器運行時間內(nèi)量化1018個單個單核細胞和巨噬細胞中超過2700個蛋白質(zhì)，量化的蛋白質(zhì)允許通過細胞類型識別單個細胞。

MANTIS®液體處理器是為SCoPE2工作流程四個關(guān)鍵步驟提供可靠的亞微升分配的重要組成部分，即為細胞分選板的準備、蛋白質(zhì)分解、肽標記和TMT反應(yīng)的猝滅。MANTIS®液體處理器的幾個重要特性使SCoPE2選擇了它，首先是它的單噴嘴結(jié)構(gòu)和非接觸式分配能力。由于每個孔包含不同的細胞類型（圖3），必須避免交叉污染。

圖3:在MANTIS®液體處理器上分配的隨機布局示例：綠色-載體，藍色-細胞1型，紅色-細胞2型，黑色-控制（無細胞）。

MANTIS®液體處理器的理想特性是它與各種試劑的兼容性。雖然分配水溶液對大多數(shù)液體處理平臺沒有什么問題，但準確分配亞微升體積的困難液體，如100%乙腈（用于存儲和稀釋 TMT標簽）是具有相當挑戰(zhàn)性的。最后，通過高度直觀的軟件，可以方便且快捷地集成到現(xiàn)有的工作流程中，MANTIS®液體處理器使斯拉沃夫?qū)嶒炇业难芯咳藛T能夠繼續(xù)開發(fā)SCoPE2，不會因為儀器設(shè)置造成延誤。