InnoScan文獻(xiàn)解讀：基于抗體微陣列的細(xì)胞外囊泡蛋白多重分析技術(shù)
技術(shù)原理與工作流程
EVPio技術(shù)的核心分為三個(gè)步驟：
1. 抗體微陣列捕獲EVs：通過噴墨打印技術(shù)在醛基化玻片上制備16個(gè)抗體微陣列，每個(gè)陣列包含10×10的抗體斑點(diǎn)（圖1A,1B），靶向EVs表面蛋白（如EpCAM、CD9等）。
圖1:A, B
2. 抗原修復(fù)（AR）與透化處理：優(yōu)化后的AR條件（90°C PBS處理1分鐘）打破了EVs內(nèi)部蛋白的交叉連接，使其能被抗體識(shí)別（圖2A）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，AR處理后HSP90（內(nèi)蛋白）信號(hào)提升至51,000 RFU，而EGFR（外蛋白）信號(hào)保持相對(duì)穩(wěn)定。
圖2: A
3. 多重檢測與信號(hào)放大：采用寡核苷酸條形碼標(biāo)記的檢測抗體和分支DNA擴(kuò)增技術(shù)（圖3，A，B, C）。其中，雙分支DNA樹（4個(gè)熒光基團(tuán)）的信噪比（SNR）與傳統(tǒng)的生物素-鏈霉親和素法相當(dāng)（圖3D）。
圖3.
InnoScan的作用：該掃描儀用于熒光信號(hào)的定量采集，通過多通道成像（如Alexa Fluor 488、Cy5等）解析不同蛋白的表達(dá)水平。HT29 EVs通過InnoScan三色熒光信號(hào)（Alexa Fluor 647、Cy3、Alexa Fluor 488nn）同步檢測HSP70、CD9和CD63。
關(guān)鍵數(shù)據(jù)與發(fā)現(xiàn)
研究以結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT29和SW403）的EVs為模型，通過四種表面蛋白（EpCAM、CD9、CD63、CD81）捕獲EVs, 并檢測12種內(nèi)外蛋白的共表達(dá)模式（圖5）。
圖5. 對(duì)四種捕獲抗體和陰性對(duì)照（GFP）所結(jié)合的HT29與SW403細(xì)胞外囊泡（濃度1.8×10¹⁰顆粒/毫升）進(jìn)行多重EVPio分析，通過四個(gè)獨(dú)立的三重檢測同時(shí)分析12種內(nèi)外蛋白。(A)HT29與(B)SW403囊泡的表型分型結(jié)果。SW403的數(shù)據(jù)以SW403與HT29信號(hào)比值呈現(xiàn)，突出兩細(xì)胞系囊泡差異。內(nèi)部蛋白標(biāo)為紅色強(qiáng)調(diào)。HT29囊泡中CD9⁺亞群總體信號(hào)最強(qiáng)，其中ITG α6、CD63、ITG β1和ITG β4為顯著檢出標(biāo)志物，HSP70與Alix是最強(qiáng)內(nèi)部靶點(diǎn)。SW403囊泡的EpCAM⁺亞群中ITG α6、CD9和CD81信號(hào)顯著更高。灰色數(shù)值表示未檢測到信號(hào)。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)與局限性
EVPio 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1.高通量：單張玻片可分析16個(gè)樣本，12個(gè)指標(biāo)檢測。
2.靈敏度：分支DNA擴(kuò)增提升了低豐度內(nèi)蛋白的檢出限。
3.靈活性：寡核苷酸條形碼避免了抗體物種限制。 局限性：AR處理會(huì)降低外蛋白信號(hào)，需通進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。此外，Cy3通道易受背景干擾，建議改用近紅外熒光基團(tuán)。
總結(jié)與展望
EVPio技術(shù)通過整合抗體微陣列、InnoScan掃描儀和分支DNA擴(kuò)增，為EVs蛋白組學(xué)研究提供了新工具。未來可應(yīng)用于臨床樣本分析，例如通過EVs蛋白特征鑒定癌癥亞型。研究者計(jì)劃進(jìn)一步優(yōu)化抗原修復(fù)條件，并探索與測序技術(shù)的聯(lián)用，以提升多重檢測能力。
文獻(xiàn)原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acssensors.2c01750
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