神經(jīng)退行性疾病（ND）以神經(jīng)元功能的進(jìn)行性損害和喪失為特征^[1]。小腦神經(jīng)退行性疾病（CBND）表現(xiàn)為小腦性共濟(jì)失調(diào)。現(xiàn)有的治療方法不能完全糾正潛在的神經(jīng)退行性疾病過(guò)程。浦肯野細(xì)胞的線粒體損傷已被確定為小腦神經(jīng)退行性疾病的核心機(jī)制。針對(duì)浦肯野細(xì)胞的線粒體干預(yù)可能是對(duì)抗該疾病的一種有前途的治療策略。

研究表明，線粒體移植可以增強(qiáng)受體細(xì)胞中的電子傳遞鏈活性，降低活性氧水平，從而抑制神經(jīng)元凋亡和壞死^[2]。此外，線粒體移植通過(guò)消除損傷的線粒體從而改善受體細(xì)胞的功能^[3]。移植健康線粒體已被證明可以通過(guò)恢復(fù)神經(jīng)元中的線粒體生物能量，增強(qiáng)Leigh綜合征小鼠的神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)能力^[4]。然而，線粒體移植治療小腦神經(jīng)退行性疾病的治療潛力和潛在的分子機(jī)制仍有待充分闡明。

近日，空軍軍醫(yī)大學(xué)王亞云教授團(tuán)隊(duì)利用浦肯野細(xì)胞內(nèi)Drp1特異性敲除小鼠構(gòu)建了小腦神經(jīng)退行性疾病模型，并利用行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)在小腦局部注射肝源性線粒體，研究者發(fā)現(xiàn)線粒體移植能夠顯著改善小鼠的運(yùn)動(dòng)功能、浦肯野細(xì)胞及線粒體功能。這項(xiàng)研究成果于3月22日發(fā)表于《Nature Communications》雜志上。
 

圖片來(lái)源：《Nature Communications》
（https://doi.org/10.1038/s41467-025-58189-4）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員利用Pcp2 Cre小鼠（賽業(yè)生物提供）與Drp1-LoxP小鼠（賽業(yè)生物提供）構(gòu)建了小腦浦肯野細(xì)胞內(nèi)Drp1特異性敲除小鼠（PCKO小鼠）。利用ObRb Cre小鼠（賽業(yè)生物提供）與線粒體報(bào)告小鼠（Mito-GFP-LoxP）雜交獲得了肝臟ObRb陽(yáng)性細(xì)胞線粒體外膜特異性表達(dá)綠色熒光的小鼠。采用了多種技術(shù)對(duì)線粒體移植在小腦神經(jīng)退行性疾病中的作用進(jìn)行了深入研究，包括線粒體移植、病毒調(diào)控、免疫熒光、RNAscope、組織透明化、Western Blot等技術(shù)，此外他們結(jié)合多種方法對(duì)線粒體功能進(jìn)行了檢測(cè)。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建浦肯野細(xì)胞Drp1基因敲除
02 敲除小鼠行為、浦肯野細(xì)胞功能分析
03 線粒體提取、質(zhì)量控制與移植
04 明確線粒體移植的治療效應(yīng)與時(shí)間窗口
05 線粒體移植發(fā)揮效應(yīng)的分子機(jī)制

研究結(jié)果
研究人員使用Pcp2 Cre小鼠（賽業(yè)生物提供）與Drp1-LoxP小鼠（賽業(yè)生物提供）成功構(gòu)建了浦肯野細(xì)胞內(nèi)Drp1基因敲除小鼠，該小鼠表現(xiàn)為小腦萎縮、浦肯野細(xì)胞進(jìn)行性丟失以及小鼠共濟(jì)失調(diào)。

 

圖1 Drp1 KO小鼠表現(xiàn)為小腦萎縮、浦肯野細(xì)胞死亡及平衡功能障礙。（a）小鼠構(gòu)建策略。（b）小鼠體重檢測(cè)。（c）小腦重量。（d-g）熒光結(jié)果分析。（h-j）浦肯野細(xì)胞DRP1蛋白及Drp1 mRNA的水平。（k-m）行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。^[5]

研究人員提取了健康C57BL/6J小鼠的線粒體，并證明這游離線粒體的功能在一個(gè)小時(shí)以內(nèi)沒(méi)有顯著變化。之后他們將游離線粒體在小腦具體進(jìn)行了注射。
 

圖2 線粒體提取及移植策略。（a - c ）線粒體提取流程。（d和e）線粒體活性檢測(cè)及確認(rèn)。（f和g）線粒體功能檢測(cè)。（h）線粒體移植流程。^[5]

將健康線粒體移植至幼年小腦退行性疾病小鼠小腦顯著改善了小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙。細(xì)胞層面表現(xiàn)為浦肯野細(xì)胞丟失和膠質(zhì)細(xì)胞的增生顯著減少。此外，稀疏標(biāo)記的結(jié)果表明線粒體移植改善了浦肯野細(xì)胞的形態(tài)。

圖3 線粒體改善Drp1 KO小鼠行為及浦肯野細(xì)胞形態(tài)。（a）時(shí)間流程。（b）平衡木實(shí)驗(yàn)。（c和d）平衡木實(shí)驗(yàn)分析。（e-h）免疫熒光實(shí)驗(yàn)及分析。（i）稀疏標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果。^[5]

線粒體移植改善了浦肯野細(xì)胞內(nèi)線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了小腦線粒體功能，包括增加ATP水平和線粒體膜電位，降低了線粒體ROS的產(chǎn)生，改善了線粒體呼吸復(fù)合物III和V。

圖4 線粒體移植改善Drp1 KO小鼠浦肯野細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)功能。（a）MiNA分析。（b）線粒體功能檢測(cè)。（c）小腦電子傳遞鏈蛋白的表達(dá)。^[5]

研究結(jié)論
總結(jié)來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究表明將肝臟來(lái)源的線粒體移植到1月齡PCKO小鼠小腦中，可改善線粒體功能，減少線粒體自噬，延緩浦肯野細(xì)胞凋亡，減輕小鼠共濟(jì)失調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，線粒體移植有望成為小腦退行性疾病的一種治療方法。

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