來源：IMMUNO隨筆

共刺激信號域的選擇，組合，拼裝對CAR-T細(xì)胞的功能，表型以及持久性都會產(chǎn)生不同的影響，最近一篇發(fā)表在Science Advances雜志上的標(biāo)題為“Dissecting the role of CAR signaling architectures on T cell activation and persistence using pooled screens and single-­ cell sequencing” 的文章利用建庫篩選與單細(xì)胞測序技術(shù)對CAR信號模塊的搭建做了很細(xì)致的研究。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程
CAR信號結(jié)構(gòu)域組合庫的構(gòu)建：研究者設(shè)計(jì)了一個包含32種不同CAR變體的組合庫，這些CAR變體基于第一代、第二代和第三代CAR設(shè)計(jì)，結(jié)合了CD28、4-1BB、CD40、CTLA4和IL15RA等五種不同的共刺激信號域，所有CAR變體均使用針對人表皮生長因子受體2（HER2）的單鏈可變片段（scFv）作為抗原結(jié)合域。

CRISPR-Cas9基因編輯：通過CRISPR-Cas9技術(shù)將CAR基因整合到T細(xì)胞的TCRα鏈（TRAC）基因座中，確保所有CAR變體在相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下表達(dá)，并同時敲除TCR，以便在混合樣本中比較不同CAR變體的功能。

體外重復(fù)抗原刺激（RAS）實(shí)驗(yàn)：模擬慢性抗原刺激，將CAR T細(xì)胞與HER2陽性的SKBR3腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，每3天重新刺激一次，觀察T細(xì)胞的效應(yīng)潛力和持久性。

單細(xì)胞CAR測序（scCARseq）：在RAS實(shí)驗(yàn)的不同時間點(diǎn)（第0天、第6天和第12天），對CAR T細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序，以解析CAR誘導(dǎo)的T細(xì)胞表型，并通過scCARseq確定每個細(xì)胞的CAR變體。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
CAR T細(xì)胞表型的動態(tài)變化：通過單細(xì)胞測序，研究者觀察到T細(xì)胞從記憶狀態(tài)到激活狀態(tài)，再到效應(yīng)狀態(tài)的動態(tài)變化，并在晚期表現(xiàn)出功能障礙和終末分化狀態(tài)。CD8 T細(xì)胞在RAS過程中比CD4 T細(xì)胞更快地失去效應(yīng)潛力，且CD8細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而CD4 T細(xì)胞比例增加。

CAR變體的持久性評估：在RAS實(shí)驗(yàn)中，CD40信號域在膜近端位置（位置A）的CAR變體顯示出最高的持久性，而CTLA4和4-1BB也在一定程度上促進(jìn)了T細(xì)胞的持久性。

CAR變體的早期激活特性：在與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)6小時后，CD40在位置A的CAR變體能夠快速誘導(dǎo)強(qiáng)烈的效應(yīng)表型，而4-1BB則傾向于誘導(dǎo)效應(yīng)記憶表型。

在這項(xiàng)研究中，五種共刺激信號域（CD28、4-1BB、CD40、CTLA4和IL15RA）在CAR結(jié)構(gòu)中的不同位置（膜近端位置A和膜遠(yuǎn)端位置B）對T細(xì)胞功能的影響被系統(tǒng)地分析。以下是每種共刺激信號域在不同位置的表現(xiàn)總結(jié)：

CD28膜近端（位置A）：CD28在膜近端時能夠有效激活T細(xì)胞，表現(xiàn)出較強(qiáng)的早期效應(yīng)功能。然而，CD28在膜近端的CAR變體在長期刺激下表現(xiàn)出較低的持久性，T細(xì)胞更容易進(jìn)入耗竭狀態(tài)。CD28膜遠(yuǎn)端（位置B）：在膜遠(yuǎn)端時，CD28的激活能力相對較弱，對T細(xì)胞的長期效應(yīng)功能影響有限。

4-1BB膜近端（位置A）：4-1BB在膜近端時能夠顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的效應(yīng)記憶表型，促進(jìn)T細(xì)胞在長期刺激下的存活。4-1BB膜遠(yuǎn)端（位置B）：在膜遠(yuǎn)端時，4-1BB對T細(xì)胞的效應(yīng)功能和持久性影響較小。

CD40膜近端（位置A）：CD40在膜近端時表現(xiàn)出最強(qiáng)的激活和持久性增強(qiáng)能力。它能夠快速誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入效應(yīng)狀態(tài)，并在長期刺激下維持較高的細(xì)胞毒性功能。CD40膜遠(yuǎn)端（位置B）：CD40在膜遠(yuǎn)端時仍能促進(jìn)T細(xì)胞的效應(yīng)功能，但對持久性的影響不如膜近端顯著。

CTLA4膜近端（位置A）：CTLA4在膜近端時對T細(xì)胞的激活和效應(yīng)功能影響有限，甚至可能表現(xiàn)出一定的抑制作用。CTLA4膜遠(yuǎn)端（位置B）：CTLA4在膜遠(yuǎn)端時表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性效應(yīng)，尤其是在CD8 T細(xì)胞中。這可能與其內(nèi)化基序有關(guān)，促進(jìn)受體循環(huán)和效應(yīng)功能的維持。

IL15RA膜近端（位置A）：IL15RA在膜近端時對T細(xì)胞的激活和效應(yīng)功能影響有限。IL15RA膜遠(yuǎn)端（位置B）：IL15RA在膜遠(yuǎn)端時對T細(xì)胞的激活和效應(yīng)功能影響有限，可能更多地起到分子間隔的作用。