慢病毒載體（Lentivirus vector, LV）是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一種包膜病毒，能夠穩(wěn)定整合在分裂和非分裂細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，且包裝容量大、細(xì)胞毒性和免疫原性低、感染譜廣、可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢(shì)，是當(dāng)前基因治療和細(xì)胞療法廣泛使用的病毒載體之一。
 
慢病毒載體是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120nm，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)、球形，包裝容量一般為4.5~5kb；慢病毒的活性容易受生產(chǎn)工藝中的壓力，剪切力，溫度，鹽濃度，pH等影響。
 
下面從幾個(gè)核心步驟來介紹下慢病毒下游工藝開發(fā)策略：
慢病毒載體下游分離純化工藝基本上采用層析分離技術(shù)和中空纖維膜兩大技術(shù)。一般病毒載體純化層析會(huì)用到分子篩，復(fù)合模式和離子交換層析等多種層析方式；中空纖維技術(shù)包括澄清過濾，切向流過濾兩方面。
 
慢病毒純化基本流程及核心工藝步驟優(yōu)化點(diǎn)如下：

 
01 澄清收獲
澄清過濾主要是去除介質(zhì)中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片及部分的HCD，HCP，并降低粘度。常用的方法為深層過濾，離心，死端過濾，或者其中兩種方法結(jié)合為主，但對(duì)于50L以上規(guī)模的慢病毒載體的澄清傾向于深層過濾或0.2~0.5μm中空纖維。
 
02 超濾濃縮 1
對(duì)澄清過濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對(duì)慢病毒載體溶液濃縮換液，可以去除一部分的蛋白，DNA片段等雜質(zhì)分子。濃縮過程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi，通量>50LMH，濃縮5-10倍。
 
03 核酸酶孵育
加入Benzonase核酸酶，降低DNA分子大小及粘度。核酸酶孵育一般溫度在在25～37℃，處理時(shí)間30～60 min；或溫度控制在2~8℃，過夜處理，核酸酶濃度在20-50 U/mL，Mg²⁺離子濃度在1‑10 mM。
 
04 層析純化
層析純化在慢病毒載體中占有重要地位，一般選擇MaXtar^® Q和兩步層析結(jié)合的方式，去除HCP，DNA片段及質(zhì)粒殘留等雜質(zhì)；MaXtar^® COLL 700（分子篩或多模式層析）層析對(duì)小于700KD的HCP，HCD及其他雜質(zhì)成分進(jìn)入層析介質(zhì)基球的內(nèi)孔，通過離子相互作用疏水左右被保留，而大于700KD的慢病毒不進(jìn)入內(nèi)孔流穿，從而實(shí)現(xiàn)分離；MaXtar^® Q以離子相互，與慢病毒載體結(jié)合，保留在MaXtar^® Q層析柱上，通過鹽梯度，去除工藝雜質(zhì)，收獲高活性的慢病毒載體。
 
由于慢病毒載體受壓力，剪切力，溫度，鹽濃度，pH等因素的影響易聚集，易失活，純化工藝中的一般工藝參數(shù)，在15~25℃溫度下層析條件優(yōu)化：MaXtar^® COLL 700/400 載量: 3~15CV，流速：150~300cm/h；MaXtar^® Q 載量：5~50CV，洗脫鹽濃度：0.5~0.8M NaCl，洗脫液要及時(shí)稀釋降低鹽濃度。
   
Case1：COLL 700 在慢病毒上的應(yīng)用案例
 
 
Case2：COLL 700在慢病毒上的應(yīng)用
 
   
05 超濾濃縮 2
對(duì)澄清過濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對(duì)慢病毒載體溶液濃縮換液。濃縮過程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi，濃縮慢病毒載體至合適的滴度和換液至制劑需要的緩沖液。
 
對(duì)于不同慢病毒載體可以選擇以下百林科的產(chǎn)品進(jìn)行純化分離：  
 
 
以上幾款百林科層析介質(zhì)產(chǎn)品特點(diǎn)可匯總?cè)缦卤恚?/strong>  
 

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