電穿孔效率受到多個關鍵因素的影響，這些因素在實驗中需要仔細考慮和控制。

外加電場的強度是影響電穿孔效率的重要因素。如果電壓過低，細胞的質膜改變不足以讓DNA通過；反之，電壓過高則會對細胞造成不可逆的損傷。研究發現，對于大多數哺乳動物細胞系，當電壓在250~500V/cm范圍內時，可以觀察到最高的瞬時表達水平。然而，即便在這樣的電壓條件下，電穿孔后通常也只有20%到50%的細胞能夠存活。

電脈沖時間的長短也是一個關鍵參數。電脈沖的持續時間、電場形狀和強度受到電源容量和電穿孔杯尺寸的限制。大多數電穿孔裝置允許研究者根據需要調整脈沖參數。在電脈沖形狀的選擇上，電穿孔儀通常提供指數衰減波和方形波兩種選項。

溫度也是一個需要考慮的因素。有些研究表明，在電穿孔過程中將細胞維持在室溫可以獲得最高的瞬時表達水平；而另一些研究則發現在0C條件下可以獲得更好的結果。這種差異可能是由于不同細胞類型或電穿孔過程中產生的熱量不同所致。特別是在使用高電壓和長時間電脈沖時，產生的熱量可能會更多。

DNA的構象和濃度也對電穿孔效率產生顯著影響。雖然線性和環狀DNA都可以通過電穿孔進行轉染，但線性DNA通常能夠實現更高的瞬時表達和穩定轉化水平。同時，DNA的濃度也需要控制在一定范圍內，通常在1~40μg/mL之間可以獲得高效的轉染。此外，質粒的純度也是影響電穿孔效率的關鍵因素。

培養基的離子成分同樣不能忽視。研究表明，使用緩沖鹽溶液（如HEPES鹽緩沖液）懸浮細胞進行電穿孔，其轉染效率要高于使用含有非離子物質（如甘露糖或蔗糖）的緩沖液。

細胞的生理狀態也對電穿孔效率有著重要影響。生長活躍、狀態健康、無污染且低代次的細胞通常能夠獲得最佳的轉染效果。

要想提高電穿孔效率，需要綜合考慮電場強度、電脈沖時間、溫度、DNA構象和濃度、培養基離子成分以及細胞生理狀態等多個因素，并進行合理的控制和調整。