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3T3-L1細胞培養及經典成脂誘導“雞尾酒”過程攻略及步驟

瀏覽次數:1034 發布日期:2023-11-30  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

流行性肥胖是近幾年的一大健康挑戰,肥胖促使一些心血管疾病如高血壓、血栓等發病率增高,糖尿病則是以高血糖為特征的代謝性疾病,長期存在可導致各種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。3T3-L1細胞——小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪細胞)系具有向脂肪細胞分化的特性,被廣泛用于研究糖尿病,肥胖癥等。 

 

(圖一)3T3-L1細胞形態 

 

(表一) 3T3-L1基礎培養信息

細胞名稱 3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細胞)
來源 18 天左右胎齡的 Swiss 小鼠胚胎
生長方式 貼壁生長
細胞形態 成纖維細胞樣
培養條件 95%空氣 5%CO2 37℃
推薦營養體系 DMEM(abs9483)+10% NBCS(abs978)+1%P/S(abs9244
傳代 0.25%Try(abs47014937)消化5-15min 1:3-1:4傳代
凍存液配制 完全培養基+5%DMSO(abs9187)

 

培養小提示:
1、 Never allow culture to become completely confluent.!!!細胞匯合度達到70-80%時進行傳代。
2、為了避免細胞聚團,在等待細胞消化的過程中,不要通過擊打或搖晃瓶子來刺激細胞。難以消化的細胞可以放置在37℃。
3、正常培養(非脂肪誘導期)出現空泡時,請優先考慮環境壓力。造成壓力的原因包括培養基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌藥物、培養基中二氧化碳、碳酸氫鈉濃度不當或培養基的營養物質耗盡。
4、使用胎牛血清可能會造成細胞分化!!!  

 

3T3-L1成脂誘導“雞尾酒”策略 (圖二)3T3-L1細胞(正常)和3T3-L1成脂分化后(對照)
 

一般認為,細胞的增值和分化呈負相關,細胞開啟分化必先退出分裂增值周期,常用的方法就是讓其生長至融合期,出現接觸抑制。脂肪生成是一個將碳水化合物和其他底物轉化為脂肪酸,然后作為TAGs(甘油三酯)儲存起來的過程。

經典“雞尾酒”法中,胰島素樣生長因子(IGF-1)激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導細胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制劑(IBMX)通過激活cAMP 依賴性蛋白激酶途徑增強 CCAAT/增強子結合蛋白家族 (C/EBPs)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ( PPARγ) 表達促進成脂分化、地塞米松促進C/EBPs的表達。

 

3T3-L1經典成脂誘導過程

誘導步驟:將融合后的3T3-L1(匯合度100%)細胞從DMEM生長培養基切換到含有0.5 mmol/L IBMX(abs817348)、10 mg/mL胰島素和1μmol/L地塞米松的分化培養基中48h。然后將細胞維持在含有10%FBS和10 mg/mL胰島素的DMEM培養基中48h,之后每隔一天更換常規新鮮培養基,一般第九天染色。

 

PS:不同產品活性純度不同,濃度僅供參考,不同誘導方案略有差異,IBMX(abs817348)用DMSO溶解時需要超聲破碎。

 

染色:油紅O儲存液與超純水按 3:2 稀釋混勻,過濾,避光靜置后酒紅色且無沉淀,現配現用,2h內用完。
用 PBS 磷酸緩沖液小心漂洗細胞三次,以2mL/孔(六孔板)的劑量加入4%多聚甲醛,室溫固定40min,再用蒸餾水漂洗2次,每孔加入油紅O工作液1mL,常溫染色15min,蒸餾水漂洗至無殘渣,蒸餾水漂洗后加入PBS鏡下觀察。

 

PS:清洗細胞時動搖要輕柔,防止脂滴脫落,油紅O工作液一定要過濾至無沉淀,否則染色后有殘渣且較難沖洗!!!

 

“雞尾酒”誘導策略進擊版
有研究者探索了葡萄糖濃度和誘導液2(含10mg/mL胰島素的低糖培養基)的作用時間對3T3L1細胞成脂分化率的影響,結果顯示,低糖培養基誘導時成熟脂肪細胞形成率明顯增高,誘導液2作用時間為3d時,成熟脂肪細胞形成率明顯高于其他組。 

 

注:文中圖片來源于網絡,僅供學習參考用

 

參考文獻
[1]    Ling HY, Wen GB, Feng SD, Tuo QH, Ou HS, Yao CH, Zhu BY, Gao ZP, Zhang L, Liao DF. MicroRNA-375 promotes 3T3-L1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal-regulated kinase signalling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011 Apr;38(4):239-46. doi: 10.1111/j.1440-1681.2011.05493.x. PMID: 21291493; PMCID: PMC3086632.
[2]    [1]張軼博,鐘悅,曾瑞霞.HAmLET誘導小鼠前脂肪細胞3T3-L1成脂分化[J].錦州醫科大學學報,2022,43(04):14-19.DOI:10.13847/j.cnki.lnmu.2022.04.022.
[3]    [1]張曉琴. 優化3T3L1細胞成脂誘導模型并初步探討miR-222-3p對脂肪生成的作用[D].湖北中醫藥大學,2020.DOI:10.27134/d.cnki.ghbzc.2020.000193.

發布者:上海優寧維生物科技股份有限公司
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標簽: 細胞培養
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