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化學(xué)發(fā)光western blot實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵技巧及流程介紹

瀏覽次數(shù):2210 發(fā)布日期:2023-11-2  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

基于化學(xué)發(fā)光的western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù)是目前蛋白質(zhì)檢測(cè)的主流方法。此技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理是樣品特異性結(jié)合一抗和HRP酶聯(lián)二抗后,加入化學(xué)發(fā)光底物,酶催化底物發(fā)光。在發(fā)光檢測(cè)環(huán)節(jié)中,傳統(tǒng)方法使用壓片(x光片)檢測(cè),隨著科技的發(fā)展,目前主要使用數(shù)字化成像系統(tǒng)(如chemiSOLO化學(xué)發(fā)光成像儀)進(jìn)行成像檢測(cè)。

化學(xué)發(fā)光western blot 方法的優(yōu)勢(shì)是高達(dá)fg 級(jí)的檢測(cè)靈敏度,是確定目的蛋白表達(dá)與否的比較常規(guī)的定性檢測(cè),可用于檢測(cè)外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),確認(rèn)純化的某種已知蛋白,或進(jìn)行抗體的驗(yàn)證等。

 

圖片
化學(xué)發(fā)光western blot示意圖

化學(xué)發(fā)光western blot實(shí)驗(yàn)操作流程較為復(fù)雜,需要優(yōu)化的點(diǎn)也非常多。其中,高背景就是困擾廣大科研工作者最常見(jiàn)的問(wèn)題之一:如整體的高背景將目的蛋白信號(hào)淹沒(méi);亮點(diǎn)、斑塊隨機(jī)散布在印跡膜上。那么,如何獲得目的蛋白低背景、高信號(hào)強(qiáng)度(高信噪比)的檢測(cè)結(jié)果呢?

答案來(lái)了!
化學(xué)發(fā)光western 完美實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵技巧:
·
優(yōu)化蛋白上樣量。可進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)_定最佳上樣量,也可保證成像儀獲取最佳成像數(shù)據(jù)。
· 選擇合適的印跡膜,根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可選擇NC膜和PVDF膜。
· 保持潔凈,使用前對(duì)托盤(pán)等設(shè)備進(jìn)行清洗,戴手套處理凝膠,用鑷子處理膜等。
· 確認(rèn)所有的buffer都混合均勻,尤其是封閉液和抗體孵育buffer,若混合不均勻,極易引起高背景,buffer最好過(guò)濾后使用。
· 如果背景較高,可使用大劑量的洗滌buffer清洗或者增加洗膜的間隔時(shí)間和次數(shù)。
· 嘗試使用不同的封閉液,某些抗體可能會(huì)與封閉液反應(yīng)引起高背景,某些封閉液可能阻礙抗體和目的蛋白的結(jié)合,脫脂牛奶和牛血清白蛋白BSA是最常用的印跡膜封閉液,封閉液可用作一抗的稀釋液,減少非特異性條帶的出現(xiàn)。
· 可采用點(diǎn)雜交的方法摸索一抗和二抗的最佳稀釋比例,能較好的降低背景。
· 不要使用帶有疊氮化鈉的抗體稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體,因?yàn)榀B氮化鈉會(huì)抑制HRP 的活性。
· 使用足夠多的底物,確認(rèn)印跡膜孵育均勻。
· 嘗試使用不同底物增加靈敏度和信號(hào)持續(xù)時(shí)間,不同底物適用于不同印跡膜的檢測(cè),有的適用低豐度蛋白,有的適合高豐度蛋白;不同底物具有不同反應(yīng)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間,從而影響成像效果。
· 為增加酶活性,化學(xué)發(fā)光底物使用前需在室溫下進(jìn)行平衡。
· 使用數(shù)字成像檢測(cè)遠(yuǎn)優(yōu)于膠片,數(shù)字成像的動(dòng)態(tài)范圍較寬,不易出現(xiàn)過(guò)飽和現(xiàn)象,且具有過(guò)飽和提示功能。

發(fā)布者:Azure Biosystems Inc
聯(lián)系電話(huà):4007507890
E-mail:azurechina@azurebiosystems.com

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