在臨床應用中，慢病毒作為細胞與基因治療的常用載體，相關制劑的純度和質量均需符合GMP標準。而慢病毒生產過程中會引入非病毒成分的雜質（如細胞碎片、蛋白聚集體）和病毒成分的雜質（如空殼病毒、游離RNA等）。因此，對生產過程中以及慢病毒終產品進行多維度的定量分析必不可少，亟需一種快速、高通量的慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等指標的檢測方法。

NanoFCM基于自身的技術平臺開發了一種高靈敏、快速、直接、無創的慢病毒表征解決方案，在前期研發、生產、純化、質控、穩定性評估等各個階段均具有極高的應用價值。該方法操作簡單、檢測速度快、準確性高、適用性廣，適用于不同種類的病毒樣顆粒和病毒載體的分析。主要優勢如下，

低損耗
僅需（10 mＬ）上樣量，且單次檢測樣品消耗量不足1 mＬ。

多參數
單次檢測可實現多種結構組分鑒定，為慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等信息提供快速檢測方案。

高通量
檢測僅需2-3 min即可獲得高通量并具有統計代表性的數據結果，擁有完整的試劑解決方案，無需摸索實驗流程。
 

圖.慢病毒高通量表征平臺

本期小編將基于慢病毒的表征平臺展開方案介紹：

粒徑、濃度檢測
納米流式檢測儀以每分鐘高達上萬個顆粒的檢測速率實現單個慢病毒的逐一檢測，獲得具有統計代表性的粒徑分布和濃度信息（如下圖1所示），也可快速獲得不同亞群的信息，對慢病毒樣品進行梯度稀釋，NanoFCM的檢測結果與稀釋度呈現很好的線性結果（R²>0.99）。這種多、快、省的檢測方法，可用于慢病毒生產過程中增殖狀態的實時監控。
 

圖1. 慢病毒粒徑、濃度和稀釋線性測試

膜染料測定純度
我司研發的膜染料可對慢病毒生產過程中無膜結構的顆粒進行純度分析，經脂膜染料標記，結果顯示該慢病毒樣本純度為91.2%（如圖2所示），揭示慢病毒樣本中絕大部分為具有膜結構的顆粒，且熒光強度與顆粒粒徑正相關。
 

圖2. 膜染料標記的慢病毒純度（膜染料訂購信息如下表所示）
 

核酸包裝效率分析
核酸染料可透過慢病毒莢膜及衣殼蛋白，與內部核酸分子結合而發出熒光。如圖3所示，該慢病毒載體樣本中絕大部分的顆粒成功裝載了基因組（89.7%），但仍存在一部分未裝載核酸的慢病毒顆粒。
 

圖3. 核酸染料標記的慢病毒純度（核酸染料訂購信息如下表所示）
 

慢病毒膜內蛋白p24測定
經膜透化試劑處理和抗體標記，NanoFCM可對慢病毒莢膜內部的蛋白進行定量分析，從而實現p24等慢病毒內部蛋白的檢測。下圖4顯示的是該慢病毒樣本中，p24陽性率僅為55.1%，結合上述莢膜和核酸染色的數據揭示并非所有的慢病毒顆粒均有p24蛋白的表達。
 

圖4. 病毒內部蛋白p24檢測（p24檢測相關試劑訂購信息如下表所示）

功能性慢病毒測定
慢病毒樣本中往往是多種組分共存，如完整慢病毒、部分組裝的慢病毒、游離核酸等。VSV-G陽性的慢病毒可侵染細胞——“識別”，核酸陽性慢病毒攜帶靶基因——“貨物”，故功能完整的慢病毒需要同時具有基因組和VSV-G。如下圖5所示，通過對慢病毒樣品進行核酸和VSV-G蛋白熒光標記，NanoFCM僅需要2-3 min就可以區分完整病毒、空殼、游離核酸等不同結構。
 

圖5 功能性慢病毒顆粒檢測（病毒組分鑒定相關試劑如下表所示）

慢病毒滴度測定比較
慢病毒滴度測定常通過ELISA對p24進行定量分析進而計算出慢病毒物理滴度，或通過侵染活性測試確定轉導滴度。與p24定量方法相比，NanoFCM可直接測定慢病毒的顆粒濃度，通過對莢膜內p24蛋白的標記，實現p24陽性的病毒顆粒的定量分析。進一步通過核酸和VSV-G標記，發展了對功能性慢病毒進行快速定量分析的方法。基于NanoFCM發展的慢病毒定量分析方法與轉導滴度的結果對比（如圖6），結果表明該慢病毒的particle-to-PFU ratio為100以上，針對p24蛋白的ELISA病毒滴度測定極易受游離p24蛋白的影響，相比之下NanoFCM所得結果與病毒的物理滴度更為吻合。
 

圖6. 慢病毒滴度測定