細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的分類及不同方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)比較
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指利用各種物理、化學(xué)、生物學(xué)方法，將外源分子（DNA、RNA 、mRNA等）導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，來改變細(xì)胞的特性，從而達(dá)到改造細(xì)胞的目的，它是實現(xiàn)細(xì)胞基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)研究的重要工具。
根據(jù)導(dǎo)入的外源分子存在于宿主細(xì)胞的時間長短，細(xì)胞轉(zhuǎn)染可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式又可以分為：物理轉(zhuǎn)染法、化學(xué)轉(zhuǎn)染法及生物轉(zhuǎn)染法。
物理轉(zhuǎn)染法：電穿孔法、顯微注射法、基因槍法
化學(xué)轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物法、陽離子脂質(zhì)體法
生物轉(zhuǎn)染法：病毒介導(dǎo)法
對于了解或做過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗的研究人員，想必上述方法大家都是非常熟悉的，我們也總結(jié)了這些方法的原理以及優(yōu)缺點(diǎn)比較(表1)，幫助大家找到適合自己實驗的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。
| 轉(zhuǎn)染方式 | 具體方法 | 原理 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | 應(yīng)用 |
| 物理法 | 電轉(zhuǎn) | 通過脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔將外源分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi) | •操作簡單，可迅速轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞 •轉(zhuǎn)染效率高 •無需載體 •適用于各種細(xì)胞 •體內(nèi)體外均可實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移 •結(jié)果可重復(fù) |
•需要儀器 •細(xì)胞的死亡率高 |
瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn) |
| 顯微注射 | 利用顯微鏡，通過微量注射針將外源基因片段注射到細(xì)胞中 | •靶向性高，可實現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)染 •適用于各種細(xì)胞 •無需載體 |
•需要儀器 •操作困難 •轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限 •細(xì)胞的死亡率高 •基因表達(dá)不穩(wěn)定 |
瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn) | |
| 基因槍 | 在強(qiáng)電場或高壓壓縮氣體驅(qū)動下使微粒子加速運(yùn)動從而進(jìn)入細(xì)胞和組織中 | •適用于各種細(xì)胞 •無需載體 |
•需要儀器 •需要制備微粒 •細(xì)胞的死亡率高 •轉(zhuǎn)染效率低 |
瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn) | |
| 化學(xué)法 | 陽離子脂質(zhì)體法 | 帶正電荷的DNA——陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞內(nèi)吞 | •快速簡單 •結(jié)果可重復(fù) •適用于各種細(xì)胞 •無需載體 |
•轉(zhuǎn)染效率受到細(xì)胞類型影響 •轉(zhuǎn)染時要除血清 •有細(xì)胞毒性 |
瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn) |
| 陽離子聚合物法 | 帶正電的聚合物——DNA復(fù)合物，被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞內(nèi)吞 | •快速簡單 •結(jié)果可重復(fù) •適用于各種細(xì)胞 •無需載體 |
•轉(zhuǎn)染效率受到細(xì)胞類型影響 •有細(xì)胞毒性 •有些不可生物降解 |
瞬轉(zhuǎn) | |
| 磷酸鈣共沉淀法 | 磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞 | •成本低 •操作簡單 •無需載體 |
•結(jié)果可重復(fù)性差 •不適用于原代細(xì)胞 •有細(xì)胞毒性 •不適用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移 |
瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn) | |
| 生物法 | 病毒介導(dǎo)法 | 通過侵染，將外源基因有效地整合到宿主染色體上 | •轉(zhuǎn)染率較高 •適用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 •細(xì)胞毒性低 |
•需要病毒載體 •有生物安全問題 •插入片段大小有限 •操作周期長 |
瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn) |
表1：三種轉(zhuǎn)染方式的原理、優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用
通過各種轉(zhuǎn)染方法的比較，我們發(fā)現(xiàn)電穿孔法，也就是電轉(zhuǎn)，無論是在操作方法、適用范圍以及轉(zhuǎn)染效率等方面，都有著很大的優(yōu)勢。而現(xiàn)實亦是如此，由于電轉(zhuǎn)的高效、低內(nèi)毒、操作簡單，并且可以瞬時和穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，因此常常用于科研領(lǐng)域的新藥開發(fā)、癌癥研究、免疫學(xué)研究等。
傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)實驗操作流程，一般先利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞，然后對含有核酸、緩沖液、細(xì)胞的混合物給予合適的電脈沖，電脈沖會在細(xì)胞膜上形成電勢差，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時的孔使核酸進(jìn)入細(xì)胞，最后將細(xì)胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)，檢測基因表達(dá)或沉默情況。在傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)實驗中，細(xì)胞死亡率高，并且原代細(xì)胞或干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低。考慮到傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)的弊端，于是科研人員致力于開發(fā)更高效的電轉(zhuǎn)技術(shù)，電轉(zhuǎn)儀就在這時候橫空出世了，目前市面上主流使用的就是Nucleofector™電轉(zhuǎn)儀。
1998年，市場上第一個有效的、非病毒介導(dǎo)的Nucleofector™ 技術(shù)開發(fā)成功，可高效轉(zhuǎn)染傳統(tǒng)方法難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)元和細(xì)胞系，為疾病研究治療如基因治療、免疫治療和干細(xì)胞生成開發(fā)帶來了新的機(jī)遇。Nucleofector™技術(shù)是Lonza公司的專利創(chuàng)新技術(shù)，利用電擊在細(xì)胞膜上開個小孔，綜合各種特定細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序與轉(zhuǎn)染液的作用，核酸底物不僅可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，還可直接通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核。相較于傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)技術(shù)，Nucleofector™技術(shù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率可達(dá)99%，且實現(xiàn)轉(zhuǎn)染不依賴于細(xì)胞的分裂。
實驗操作步驟
1.收獲目的細(xì)胞：按照轉(zhuǎn)染需要的細(xì)胞量進(jìn)行計數(shù)，如20 µl電轉(zhuǎn)體系可轉(zhuǎn)1x104-1x106個細(xì)胞，100 µl電轉(zhuǎn)體系可轉(zhuǎn)1x105-1x107個細(xì)胞；
2.混勻：低速離心，盡量吸去細(xì)胞上清，用電轉(zhuǎn)Buffer重懸細(xì)胞，加入轉(zhuǎn)染杯，加入準(zhǔn)備好的質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡；
3.電轉(zhuǎn)：將轉(zhuǎn)染杯放入轉(zhuǎn)染儀，按鍵選擇相應(yīng)程序，按"start"鍵開始轉(zhuǎn)染，等待指示圖標(biāo)顯示綠色“+”號，即可完成實驗；
4.培養(yǎng)：吸去電轉(zhuǎn)Buffer，加入預(yù)熱好的培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。若轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為試劑盒內(nèi)的陽性對照質(zhì)粒，一般在實驗結(jié)束后7-8h內(nèi)可在熒光顯微鏡下觀察到實驗結(jié)果。
