論文發表 | 黃路生院士團隊的研究成果“BMPR-IB基因的缺失導致豬嚴重肢體畸形”

近日，江西農業大學豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室黃路生院士團隊的研究成果“BMPR-IB gene disruption causes severe limb deformities in pigs（BMPR-IB基因的缺失導致豬嚴重肢體畸形）”在ZOOLOGICAL RESEARCH（中科院1區top期刊，IF：4.560）上發表。平生公司的離活一體Micro CT（型號：NEMO）在論文中提供了重要的豬四肢骨骼圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為幸宇云教授，第一作者為楊強博士和喬傳民博士。

本文摘要

在之前的研究中，研究者們原本計劃通過CRISPR/Cas9編輯技術在豬的BMPR-IB基因中產生g.A746G的突變，然而卻意外地獲得了BMPR-IB純合敲除仔豬（BMPR-IB^-/-）和攜帶A746G突變的雜合子敲除仔豬（BMPR-IB^-/746G）。PCR檢測及測序結果顯示BMPR-IB基因區域中發生了復雜的基因組重排。所有BMPR-IB^-/-和BMPR-IB^-/746G仔豬都無法正常站立和行走。解剖學觀察發現，這些仔豬均呈現出嚴重的四肢骨骼發育異常，其中前肢的前臂骨（尺骨、橈骨）扭曲及截短，腕骨、掌骨和指骨排列紊亂；相比前肢，后肢表現出更嚴重的畸形，包括腓側半肢畸形、跗骨增大和腳趾關節骨排列紊亂。與BMPR-IB^-/746G個體相比，BMPR-IB^-/-仔豬的四肢骨骼畸形更為嚴重。通過蛋白質組學分析，在雜合子敲除仔豬（BMPR-IB^-/746G）和對照組仔豬（WT）的后肢腓骨中鑒別到139個差異表達蛋白（DEPs），大多數DEPs是已知的參與骨骼或胚胎發育、TGF-β通路或腫瘤進展的重要因子；基因本體（GO）和蛋白質結構域富集分析也顯示出這些通路上的變化。在排列前50的DEPs中，有一大部分蛋白如C1QA、MYO1H、SRSF1、P3H1、GJA1、TCOF1、RBM10、SPP2、MMP13及PHAX，均已被證明與骨骼發育顯著相關。該研究為解析BMPR-IB在哺乳動物肢體發育中的作用提供了新的認識。

實驗過程

實驗動物

使用200 U/mL IV型膠原酶從1月齡大白豬胎兒中分離PFFs。代孕母豬按照標準流程進行單欄飼養。所有動物手術均在麻醉下進行的，以最大限度地減少痛苦。本研究選用16頭3 ~ 5日齡克隆仔豬開展相關試驗，其中肢體畸形9頭，正常7頭。

實驗方法

1頭BMPR-IB^-/-、2頭BMPR-IB^-/746G和2頭野生型(WT)克隆仔豬用于骨骼表型分析。作者使用荷蘭飛利浦公司生產的雙板直接數字化成像系統(Digital Diagnost System,簡稱DR)拍攝克隆仔豬全身骨骼的x光照片。作者進一步分析了BMPR-IB缺失和WT克隆仔豬四肢骨骼的解剖結構。簡單地說，用手術刀、剪刀和鑷子來剝離和去除四肢的皮膚、肌肉和相關的粘連組織。收集BMPR-IB^-/- (n=1)、BMPR-IB^-/746G (n=2)和WT (n=2) 克隆仔豬的四肢骨骼，置于−80℃保存。采用Micro-CT系統（平生醫療科技有限公司，中國）對每頭仔豬前肢和后肢進行分析，掃描所用分辨率為50 μm，電壓為90 kV，電流為60 μA。通過測量距前肢橈骨和后肢脛骨生長板遠端2mm的2mm截面來評估骨小梁的定量。對于皮質骨，分析前肢橈骨和后肢脛骨中軸以上3mm的部分。基于閾值分割和三維測量，使用Avatar v1.6.5軟件(平生醫療科技有限公司，中國)定量分析橈骨和脛骨的骨小梁和皮質骨(BV/TV，分段骨體積與總體積的比值;BS/TV，分割骨表面與總容積的比值; Tb.Sp，骨小梁間的平均距離，采用直接3D方法評估;Tb.N，單位長度骨小梁的平均數量，是骨小梁結構的關鍵參數；Tb.BMD，骨密度測量，反映以鈣含量為代表的骨骼強度;Ct.BMD:皮質骨礦物質密度;Ct.Th為平均皮質厚度;Ct.ar/Tt.ar，皮質面積分數)。

實驗結果

克隆仔豬前肢骨骼Micro-CT分析 A: WT、BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔豬前肢骨骼的高分辨率Micro-CT掃描。B: 3種基因型仔豬橈骨的3D和2D灰度圖像。C:橈骨遠端骨小梁和皮質骨定量結果。數據為平均值±SD (WT, n=4;BMPRIB^-/746G, n=4;BMPR-IB^-/-，n = 2)。ns: P>0.05;*: P<0.05;* *: P<0.01。白色標尺，1厘米。BV/TV:骨小梁體積分數;BS/TV，骨小梁表面密度;Tb.Sp,骨小梁間距; Tb.N,骨小梁數目;Tb.BMD，骨小梁礦物質密度;Ct.BMD:皮質骨礦物質密度;Ct.Th,皮質厚度;Ct.ar/Tt.Ar:皮質面積分數。

克隆仔豬后肢骨骼Micro-CT分析 A: WT、BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔豬后肢骨骼的高分辨率Micro-CT掃描。B: 3種基因型仔豬脛骨3D和2D灰度圖像。C:脛骨遠端骨小梁、皮質骨定量結果。數據為平均值±SD (WT, n=4;BMPR-IB^-/746G, n=4;BMPR-IB^-/-，n=2)。ns: P>0.05，*: P<0.05;* *: P<0.01。白色標尺，1厘米。

結論

通過CRISPR-Cas9和SCNT獲得的BMPR-IB缺失仔豬表現出行走困難和嚴重的前肢和后肢發育畸形。BMPR-IB^-/746G和BMPR-IB^-/-仔豬表型相似。研究者們在肢體畸形的BMPR-IB^-/746G仔豬的后肢腓骨中發現139個DEPs，其中大部分參與骨骼和(或)胚胎發育。他們的研究為大型哺乳動物BMPR-IB缺失提供了新的見解。

實驗儀器

Micro CT（型號：NEMO）（平生醫療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫療科技）