炎癥是機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種保護效應(yīng)，在對抗機體感染，清除體內(nèi)異物，以及對局部組織損傷進行修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用。然而過度活化的炎癥反應(yīng)會對機體造成損傷，引起膿毒癥、糖尿病、心血管疾病、炎癥性腸病和神經(jīng)退行性疾病等一系列炎癥性疾病發(fā)生^[1-5]。在不斷進化過程中，機體免疫系統(tǒng)已產(chǎn)生許多負反饋調(diào)控機制對炎癥進行精準(zhǔn)調(diào)控，如IkB抑制NF-κB炎癥通路^[6]，A20抑制TRAF6信號通路^[7]，SOCS3抑制JAK2/STAT3炎癥通路^[8]等，這些研究都強調(diào)了負反饋調(diào)節(jié)在控制炎癥中的重要作用。

炎癥小體是機體重要的固有免疫炎癥蛋白質(zhì)機器，參與對病原的宿主免疫防御反應(yīng)。同時，炎癥小體也與眾多無菌性慢性炎癥疾病發(fā)生密切相關(guān)。因此，解析炎癥小體激活的調(diào)控機制對防治炎癥性疾病發(fā)生具有重要意義。然而，是否像其他炎癥反應(yīng)通路炎癥小體激活也存在精密高效的負反饋調(diào)控機制目前尚不可知。

2022年11月2日，南京醫(yī)科大學(xué)楊碩課題組和南京中醫(yī)藥大學(xué)胡剛/王冰微課題組合作，在PNAS雜志發(fā)表題為“The Gasdermin D N-terminal fragment acts as a negative feedback system to inhibit inflammasome-mediated activation of Caspase-1/11”的研究論文，揭示了固有免疫細胞焦亡效應(yīng)分子GSDMD負反饋調(diào)控炎癥小體激活的作用及其分子機制，為靶向炎癥小體Caspases抗炎藥物開發(fā)提供了新線索。南京醫(yī)科大學(xué)姑蘇學(xué)院博士后胡穎超，生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士研究生姜玉瑩和已畢業(yè)博士研究生李晟為本文的共同第一作者，南京醫(yī)科大學(xué)楊碩教授和南京中醫(yī)藥大學(xué)胡剛教授、王冰微教授為本文的共同通訊作者。
 

研究材料
體外研究使用了原代骨髓來源巨噬細胞（BMDM），永生化骨髓來源巨噬細胞（iBMDM），HEK293T細胞，體內(nèi)研究中研究人員構(gòu)建了髓系特異性GSDMD N端敲入小鼠（GSDMD N端Knockin小鼠由賽業(yè)公司提供）。

技術(shù)方法
蛋白印跡，F(xiàn)AM熒光探針，分子對接，免疫共沉淀，蛋白體外表達與純化，流式細胞術(shù)等。

技術(shù)路線

研究結(jié)果
研究人員通過骨髓來源巨噬細胞（BMDM）炎癥小體激活實驗，意外發(fā)現(xiàn)焦亡效應(yīng)分子GSDMD缺失后炎癥小體激活顯著增強，提示GSDMD可能負反饋調(diào)控上游炎癥小體激活。

圖1 GSDMD負反饋調(diào)控炎癥小體激活^[9]

隨后研究人員采用分別穩(wěn)定表達GSDMD全長、N端、C端的永生化的骨髓來源巨噬細胞（iBMDM），進一步證實GSDMD活化產(chǎn)生的N端片段可特異性抑制炎癥小體蛋白酶Caspase-1/11激活，進而發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)作用。

圖2 GSDMD通過N端發(fā)揮負反饋調(diào)控效應(yīng)^[9]

隨后，研究人員構(gòu)建了帶有LSL表達盒的GSDMD N端序列Knockin小鼠（GSDMD-N^LSL，由賽業(yè)生物提供），與LysM-Cre工具鼠配繁，得到GSDMD N端片段髓系特異性敲入小鼠（GSDMD-N^LSL; LysM-Cre）。通過構(gòu)建小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的多發(fā)硬化癥模型在體內(nèi)水平驗證了GSDMD N端片段負反饋抑制效應(yīng)。
 

圖3 GSDMD N端抑制NLRP3炎癥小體激活進而緩解EAE發(fā)生^[9]

為了解GSDMD N端抑制CASP1/11活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究人員接下來運用分子對接方法并結(jié)合體外實驗，發(fā)現(xiàn)GSDMD N端β1-β2環(huán)區(qū)段RFWK基序可通過疏水鍵和氫鍵等結(jié)合Caspase-1/11酶L1-L4口袋，進而干擾Caspase酶催化活性中心。

圖4 GSDMD N通過β1-β2區(qū)段RFWK基序結(jié)合抑制CASP1/11^[9]

最后，研究人員設(shè)計了基于RFWK基序的小分子多肽抑制藥物Ac-RFWK-CMK。Ac-RFWK-CMK可以抑制Caspase-1/11的活化及其下游底物GSDMD和IL-1β的剪切，以及脂多糖誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥。

圖5 Ac-RFWK-CMK抑制Caspase-1/11剪切和炎癥小體激活^[9]

研究結(jié)論
綜上，該研究首次揭示了炎癥小體下游的負反饋調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)焦亡效應(yīng)分子GSDMD可通過活化產(chǎn)生的N端片段β1-β2環(huán)RFWK基序作用炎癥小體蛋白酶Caspase-1/11酶催化中心，進而控制炎癥小體Caspase的過度激活和炎癥反應(yīng)發(fā)生。

該研究拓展了我們對GSDMD蛋白功能的認識，為靶向炎癥小體Caspases的抗炎藥物開發(fā)提供了新線索。

參考文獻：
[1] Hotchkiss, R.S., et al., Sepsis and septic shock. Nat Rev Dis Primers, 2016. 2: p. 16045.

[2] Dandona, P., A. Aljada, and A. Bandyopadhyay, Inflammation: the link between insulin resistance, obesity and diabetes. Trends in Immunology, 2004. 25(1): p. 4-7.

[3] Libby, P., Inflammation and cardiovascular disease mechanisms. Am J Clin Nutr, 2006. 83(2): p. 456S-460S.

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[5] Amor, S., et al., Inflammation in neurodegenerative diseases. Immunology, 2010. 129(2): p. 154-69.

[6] Peng, B., et al., Defective feedback regulation of NF-kappaB underlies Sjogren's syndrome in mice with mutated kappaB enhancers of the IkappaBalpha promoter. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(34): p. 15193-8.

[7] Shembade, N., A. Ma, and E.W. Harhaj, Inhibition of NF-kappaB signaling by A20 through disruption of ubiquitin enzyme complexes. Science, 2010. 327(5969): p. 1135-9.

[8] Carow, B. and M.E. Rottenberg, SOCS3, a Major Regulator of Infection and Inflammation. Front Immunol, 2014. 5: p. 58.

[9] Yingchao Hu, Yuying Jiang, Sheng Li, et al.The Gasdermin D N-terminal fragment acts as a negative feedback system to inhibit inflammasome-mediated activation of Caspase-1/11. PNAS. November 2, 2022. doi: 10.1073/pnas.2210809119
 

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Gsdmd基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Gsdmd^em1Cya
品系編號：
KOCMP-69146-Gsdmd-B6N-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-12963
應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué),免疫系統(tǒng),生理系統(tǒng),造血系統(tǒng),細胞生物學(xué),分子生物學(xué)
打靶方案：