實驗技術 | PCR實用tips

瀏覽次數：2346　發布日期：2022-12-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis發明，至今仍廣泛使用的DNA擴增技術。它通過高溫解鏈、低溫退火、中溫擴增的過程，來實現目標片段DNA的指數級擴增。

PCR反應體系可以簡單概括為三部分：DNA模板（Template）、引物（Primer）及DNA聚合酶預混液（PreMix，MasterMix等），其中商業化的DNA聚合酶產品預混液已包括濃度優化過的DNA聚合酶、三磷酸核苷（NTPs）、Mg2+、緩沖液及惰性染料等，可以根據實驗需要選擇擴增速度、保真性不同的DNA聚合酶以及預混染料的產品。整個體系經常為20μL或50μL的體積，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。

PCR熱循環儀是實現PCR反應的外部硬件，按照設定的反應程序，利用金屬浴來按時加熱、冷卻PCR反應體系來完成解鏈、退火和擴增的過程。溫度和時間的設定受引物Tm（DNA Melting Temperature，熔解溫度）、目標序列長度及DNA聚合酶擴增速度影響。一個典型的PCR程序如下：

PCR體系組分的Tips：

1. DNA模板a)起始模板含量依據DNA類型及DNA聚合酶性質來決定。一般質粒DNA模板起始含量為0.1~1ng，基因組DNA以5-50ng為佳，例如25ng/μL的基因組DNA模板，加1μL左右就夠了。過少的模板會降低得率，過多則會導致非特異性擴增。b)模板提取過程中，模板完整性受到損壞或提取試劑殘留都可能會導致PCR反應失敗。PCR反應出現不擴增或異常時，可以考慮用電泳檢驗DNA完整性以及使用Nanodrop測定DNA純度來排除問題。2. 引物a)引物設計對長度、堿基構成、序列有很多限制，但目前很多軟件都可以輔助引物設計來規避可能出現的問題。擴增引物和用于引入點突變的引物都可以借助軟件來設計。b)引物終濃度需要控制在適配DNA聚合酶的范圍內，實際使用時可以將上下游引物預混直接加入，減少時間及槍頭成本哦。3. 水一定要用不含DNA酶（DNase-free）的水，也可以預混到引物里面，算好濃度和體積就行，體系不足的體積都由水來補足。
4. DNA聚合酶預混液
a)最后加入體系以保證對存貨（stock）的最小污染，加完后可用槍頭緩慢混勻。
b)直接上電泳的基因分型實驗可以選擇預混Loading buffer的DNA聚合酶，省去了很多加樣的時間。

PCR結束后應盡量當天進行后續實驗，或將產物置于4℃短期保存哦。

稀釋系數tips：1）10X的溶液20μL體系中加2μL，2X的溶液20μL體系中加10μL；2）4X溶液與4X溶液等體積混合后為2X預混液（Premix）。

最后劃重點，每次PCR實驗時不要忘了包括陰性和陽性對照。

附：可使用到的NEST產品
PCR系列、移液吸頭、微量離心管