當(dāng)前嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T）已經(jīng)在血液腫瘤治療領(lǐng)域取得了矚目的效果。但與小分子或抗體藥物不同的是，CAR-T是一種“活的”細(xì)胞類藥物，有諸多因素可以影響療效，其中CAR分子結(jié)構(gòu)便是一關(guān)鍵因素。

CAR分子結(jié)構(gòu)包含識(shí)別腫瘤抗原的抗體單鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)，以及胞內(nèi)的共刺激結(jié)構(gòu)域、信號(hào)傳導(dǎo)域，其設(shè)計(jì)的合理性會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)、體內(nèi)持久性、以及安全性等。因此，針對不同的腫瘤治療靶點(diǎn)，我們需要設(shè)計(jì)合理有效的CAR分子，并包裝成CAR慢病毒，用于后續(xù)CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建。
 

CAR分子設(shè)計(jì)太難？
慢病毒包裝效果不好？
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CD19抗原慢病毒包裝及滴度檢測

將表達(dá)CD19抗原的慢病毒純化液進(jìn)行梯度稀釋（0.01、0.1、1、10μl），分別加入到相同數(shù)量的293T細(xì)胞中，72小時(shí)后流式檢測293T細(xì)胞陽性率，進(jìn)而按如下公式計(jì)算慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度：

A：表示0.1μl組陽性細(xì)胞占比

B：表示0.01μl組陽性細(xì)胞占比

N：加入病毒時(shí)候細(xì)胞數(shù)量

V：表示A組中病毒的加入體積
 

圖1 CD19抗原慢病毒滴度檢測結(jié)果

（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

如圖所示，CD19抗原陽性細(xì)胞的數(shù)量隨轉(zhuǎn)染病毒梯度的增加而逐漸升高，表明該慢病毒有良好的感染活性，并按上述公式計(jì)算病毒滴度為：1.4×10⁸ Tu/ml。

CD19-293T穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

我們將成功制備的上述CD19病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)過多輪篩選獲得陽性率幾乎為100%的CD19-293T細(xì)胞，其陽性率檢測結(jié)果如下圖所示。

圖2 CD19-293T穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株陽性率檢測結(jié)果

（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

CD19-CAR慢病毒包裝及滴度檢測

我們將針對CD19靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的二代經(jīng)典CAR分子構(gòu)建到慢病毒載體中，并包裝得到CD19-CAR慢病毒，采用上述方法檢測病毒滴度，經(jīng)計(jì)算后得到病毒滴度為：4.33×10⁸ Tu/ml。

圖3 CD19 CAR分子結(jié)構(gòu)，其中VH和VL序列來源于CD19抗體FMC63克隆
 

圖4 CD19 CAR慢病毒滴度檢測結(jié)果
（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）
 

其他慢病毒感染

圖5 其他細(xì)胞慢病毒感染效果圖

CAR-T細(xì)胞治療實(shí)用指南

免疫細(xì)胞培養(yǎng)難？

↓

T細(xì)胞感染效果差？

↓

細(xì)胞鑒定缺乏條件？

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