Make it EVIDENT     

本期推出【SpinSR Makes Synapse Evident】

 

南京大學附屬鼓樓醫院/南京中醫藥大學 

孫凌云/胡剛團隊

 

補體信號與神經精神狼瘡

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種難以治愈的自身免疫性疾病，40-90% 的患者會出現神經精神癥狀，表現為焦慮、抑郁和認知障礙等，稱為神經精神狼瘡（NPSLE）。

既往觀念認為NPSLE是系統性免疫持續激活累及中樞神經系統（CNS）的后果，然而，針對這些認識的治療（免疫抑制劑及激素）并不能遏制病情進展，長期使用還易產生多種不良反應。研究表明，神經癥狀多出現在SLE病程早期，提示腦內早發致病因素的存在。靶向這些因素的發現，是深化疾病認知和治療學突破的關鍵。

補體蛋白C1q是經典補體信號的啟動因子。最近研究發現腦內C1q具有獨特的生物學功能，可以調控小膠質細胞對神經突觸的修剪，對神經環路的精準發育及衰老、阿爾茨海默病、精神分裂癥等病變過程中的突觸丟失至關重要。但對于其在NPSLE中的效應，仍然知之甚少。

神經元-補體-小膠質細胞突觸修剪調控神經精神狼瘡

2022年2月18日，南京大學孫凌云教授與南京中醫藥大學胡剛教授團隊合作，在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）上以長文形式發表題為Neuronal NR4A1 deficiency drives complement-coordinated synaptic stripping by microglia in a mouse model of lupus的研究論文，提出神經突觸丟失是NPSLE早期腦內病理，其機理系通過神經元Nr4a1-C1q-小膠質細胞協同調控的突觸修剪。

 

研究團隊首先利用自發狼瘡的MRL/lpr小鼠模型，利用綜合行為學分析系統進行動態評估，發現改模型小鼠在狼瘡病程早期（系統性病理改變及腎臟損傷之前）就已出現顯著的焦慮行為。同時模型小鼠海馬和皮層的小膠質細胞激活。這一發現提示腦損傷發生在狼瘡病程的早期，腦內小膠細胞激活可能參與狼瘡腦損傷的病理進程。

 

MRL/lpr小鼠早期（6周齡）時出現焦慮行為（上圖）

伴海馬小膠質細胞激活（下圖）

 

為了明確模型小鼠出現焦慮行為時腦內病理改變的分子機制，研究團隊對小鼠海馬組織進行RNA測序。作者發現，MRL/lpr小鼠海馬小膠質吞噬基因激活，伴隨補體信號上調，同時神經突觸傳遞、LTP信號被抑制。

 

MRL/lpr小鼠海馬屯膠質吞噬信號、補體信號激活，突觸傳遞、LTP信號抑制

 

為了進一步確定小膠質細胞吞噬激活、突觸功能異常在NPSLE中的作用，作者通過超分辨顯微成像，發現模型小鼠海馬突觸蛋白（SYN,突觸前膜; PSD-95,突觸后膜）熒光密度顯著減少。STED顯微鏡結合Imaris分析顯示，活化的小膠質細胞吞噬神經突觸增多。進一步利用藥理學方法抑制小膠質細胞吞噬功能，可以顯著緩解MRL/lpr小鼠海馬突觸丟失及焦慮行為。

 

MRL/lpr小鼠海馬突觸蛋白熒光信號顯著減少（上圖）

（使用Olympus SpinSR活細胞超分辨轉盤共聚焦顯微成像系統拍攝）

 

為了進一步明確C1q在小膠質細胞突觸吞噬中的作用，研究團隊首先通過顯微成像研究發現小鼠海馬升高的C1q多定位于突觸末端。作者進一步利用中和抗體特異性阻斷小鼠海馬C1q信號，發現C1q阻斷可緩解狼瘡小鼠的神經損傷。提示小膠質細胞突觸修剪和C1q信號共同參與NPSLE的發病。

 

C1q主要定位于突觸末梢，利用中和抗體阻斷腦內C1q信號可以緩解狼瘡小鼠的神經損傷

 

除了小膠質細胞修剪外，突觸結構或神經元內在電活性的改變也參與突觸密度的調節。但對于神經元如何與小膠質細胞溝通并協同調控突觸丟失，仍然知之甚少。

 

接下來，研究團隊對突觸修剪的神經元調控機制進行了探究。通過對MRL/Lpr小鼠海馬組織轉錄組測序，篩選出了潛在效應信號分子-Nr4a1。

 

有趣的是，抑制神經元的興奮性可以減少Nr4a1的表達，與文獻報道的降低的神經元電活性促進小膠質細胞突觸修剪的理論一致，支持Nr4a1參與狼瘡腦內突觸吞噬的作用。為了確認Nr4a1的具體調控機制，團隊制備了神經元-小膠質細胞共培養模型，并利用敲減慢病毒在原代神經元中干擾Nr4a1表達，明確神經元Nr4a1信號減弱導致突觸骨架蛋白異常，作為橋梁信號促進C1q的突觸定位，并被活化的小膠質細胞識別吞噬。

 

在原代神經元中敲減Nr4a1科減少C1q的突觸定位

 

下一步，團隊對Nr4a1調控狼瘡腦損傷的體內作用進行了探究。團隊利用先前確定的海馬立體定位注射技術和過表達慢病毒，在模型小鼠海馬神經元中過表達Nr4a1。

 

利用這一方法，團隊證明了海馬神經元Nr4a1是調控C1q定位及小膠質細胞定向突觸修剪介導NPSLE發病的關鍵信號。

 

海馬神經元特異性過表達Nr4a1緩解狼瘡腦損傷

（突觸熒光信號圖 使用Olympus SpinSR活細胞超分辨轉盤共聚焦顯微成像系統拍攝）

 

因此，該研究應用多種模型及研究方法，闡明了突觸丟失是狼瘡腦損傷的早期病理，小膠質細胞、補體信號、神經元共同參與該過程。

 

同時，該工作首次揭示神經元內在Nr4a1異常在調控C1q-小膠質細胞“突觸修剪”中的主動作用。為狼瘡腦損傷及相關疾病的早期干預提供了新策略及新靶點。

 

Nr4a1-C1q-microglia 調控突觸修剪參與NPSLE發病機制的示意圖

 

在本次研究中，小鼠海馬突觸蛋白熒光標記圖片使用了Olympus SpinSR活細胞超分辨轉盤共聚焦顯微成像系統拍攝，該系統無需特殊標記手段即可實現低至110nm的XY分辨率，成像速度可達200pfs，適合進行快速圖像拼接及低光毒性延時成像，更有利于在較大的范圍內觀察標本或者對活體樣品進行長時間觀察。在此，感謝Evident江蘇省代理商 南京奧力科學儀器有限公司市場部 毛雨 對實驗的大力支持。