抗體篩選是開發(fā)單克隆抗體藥物、雙特異抗體藥物、ADC藥物和CAR-T等細胞治療藥物的必經(jīng)之路。篩選出優(yōu)質的候選抗體，能大大提高這些藥物開發(fā)成功的可能性。近年來，我國惡性腫瘤發(fā)病、死亡率逐年上升，每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費超過2200億元。而惡性腫瘤是目前抗體藥、CAR-T等細胞治療藥物治療的最大適應，需求巨大。據(jù)統(tǒng)計，2021年我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)總市場規(guī)模已超200億元，2015-2020年平均年增長率超20%。

相比于傳統(tǒng)小分子藥物，抗體藥可作用的靶點種類更多，且出現(xiàn)耐藥性的比例相對更低，另外還可通過提升抗體藥的親和性從而降低藥物毒副作用。自1986年第一個治療性抗體莫羅單抗-CD3（Muromonab-CD3）被批準上市，到目前為止已經(jīng)有100多個抗體批準上市。在2018年，全球藥品銷售額Top10中，抗體藥就占據(jù)了8個，包括6個單抗藥物和2個抗體融合蛋白，并且銷售額占比呈上升趨勢。
 

圖1 2018年全球藥品銷售額Top10

針對某個特定靶點開發(fā)創(chuàng)新性抗體藥或CAR-T細胞治療藥物，第一步是篩選出候選抗體。目前常見的抗體發(fā)現(xiàn)方法包括雜交瘤技術、噬菌體展示技術、單個B細胞抗體篩選技術等。

一、雜交瘤技術
1975年，克勒（Kohler）和米爾斯坦（Milstein）將小鼠骨髓瘤細胞和經(jīng)免疫的小鼠脾細胞進行融合，獲得了既可產(chǎn)生單克隆抗體又可無限增殖的雜交瘤細胞。迄今為止，雜交瘤技術已發(fā)展非常成熟，是目前制備抗體應用最廣泛的技術，在已批準上市的治療性抗體中，多數(shù)來自于雜交瘤小鼠。

通過雜交瘤技術獲得單克隆抗體的技術流程大致為：

(1）選擇合適抗原免疫動物（一般為小鼠）；

(2）分離小鼠脾臟細胞并與骨髓瘤細胞融合；

(3）篩選雜交瘤細胞獲得分泌目標抗體的陽性單克隆雜交瘤細胞；

(4）擴大培養(yǎng)陽性單克隆雜交瘤細胞；

(5）體外培養(yǎng)或體內(nèi)誘生法獲得大量的單克隆抗體。
 

圖2 雜交瘤技術制備抗體流程

雜交瘤的整個過程具有一定的復雜性和技巧性，例如在免疫動物的過程中，通常在注射抗原時使用佐劑，從而避免非特異性的免疫反應將抗原快速分解，達到抗原緩慢釋放并作用免疫系統(tǒng)，最終提高產(chǎn)生親和性較高抗體的效率；再比如，作為單克隆抗體制備過程中最為關鍵的一個環(huán)節(jié)，細胞融合率直接影響抗體的制備，特別是對于小鼠脾臟的處理，更要十分小心，稍不注意就會影響最終的融合效率。

雜交瘤技術可確保不同批次制備的抗體質量相同，更加易于復制，是一種高效的抗體制備技術。但傳統(tǒng)的雜交瘤得到的是鼠源抗體，如不進行人源化改造，進入人體內(nèi)會產(chǎn)生針對鼠抗的抗體（Human Antimous Antibody，HAMA），HAMA不僅會導致抗體被快速清除，縮短半衰期進而影響療效，嚴重則引發(fā)嚴重免疫反應，存在安全性風險，因此鼠源抗體需經(jīng)過復雜的人源化改造才可用于臨床上治療。另外，鼠源抗體的可變區(qū)難以與人類抗原交互，誘發(fā)ADCC的效應相對弱，因此無法有效殺滅目標。

因此近年來，人源抗體越來越受到關注，并成為未來的發(fā)展方向。根據(jù)人源比例和部位不同可進一步為三大類:
(1) 人鼠嵌合單抗：恒定區(qū)來自人類，可變區(qū)來自小鼠（鼠源成分~35%）；
(2) 人源化單抗：恒定區(qū)來自人類，可變區(qū)為人鼠序列結合（鼠源成分~10%）；
(3) 全人源化單抗：恒定區(qū)及可變區(qū)均來自于人類（鼠源成分0%）。
 

圖3 不同人源抗體的人源化程度

近年來，越來越多的全人源抗體藥物獲批上市，截至目前已經(jīng)有36款全人源抗體獲批上市，例如2021年5月上市的Amivantamab（楊森生物）是一種靶向c-MET/HGFR和EGFR的雙特異性抗體，對于EGFR突變的非小細胞肺癌具有良好的治療效果。目前，制備人源抗體常用的技術有噬菌體展示技術和轉基因小鼠雜交瘤技術。

二、噬菌體展示技術
噬菌體展示技術（phage display）是由George P. Smith于1985年開發(fā)的一種體外篩選抗體的方法。通過將外源編碼多肽或蛋白質的基因插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，隨子代噬菌體的重新組裝呈現(xiàn)在噬菌體表面，可以保持相對的空間結構和生物活性。再利用噬菌體庫篩選對目標抗原有結合的抗體進行多輪的篩選，并且在大腸桿菌中擴大，該過程也被稱為“淘選”。反復的篩選可逐步提高特異性識別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。
 

圖4 噬菌體展示技術一般技術流程
 

噬菌體展示技術會用到抗體庫，而抗體庫一旦建成，便可永久保存，不需要反復免疫和建庫，允許反復篩選，且篩選后不再需要對每個抗體基因進行單獨克隆，直接進行分子轉化，而雜交瘤的候選克隆無法長期穩(wěn)定，初篩和亞克隆的時間窗口很短，有時需要反復免疫、融合和篩選，費時費力。另外噬菌體展示技術可以針對的抗原極為廣泛，但由于噬菌體無法浸染過長的序列，因而需要額外加入“組合”步驟，而組合后的單抗偶爾會出現(xiàn)失去親和力或者產(chǎn)生自體免疫的現(xiàn)象。

三、轉基因鼠雜交瘤技術
1985年，Alt等人首次提出利用轉基因小鼠產(chǎn)生全人源的抗體的概念。轉基因抗體小鼠的構建需要通過轉基因技術創(chuàng)造出缺乏原有抗體基因的小鼠胚胎，再將人源抗體基因移植入小鼠體內(nèi)，迫使小鼠表達的抗體全部擁有人源序列，進而再通過傳統(tǒng)雜交瘤創(chuàng)造出全人源抗體。

此種生產(chǎn)方法能夠通過選擇雜交瘤從而出產(chǎn)親和力極高的全人源單抗，比傳統(tǒng)的嵌合抗體更具免疫多樣性。但是由于增加的轉基因步驟需要從胚胎階段開始培育小鼠，且需要植入的基因序列極長，以被準確表達，其生產(chǎn)過程比傳統(tǒng)雜交瘤復雜得多。

相比于鼠源抗體，人源抗體可以更好地避免耐藥性的發(fā)生。鼠源抗體仍可被免疫系統(tǒng)識別，并觸發(fā)免疫系統(tǒng)介導的排斥反應，這使得在反復用藥時身體會產(chǎn)生大量中和抗體從而減弱藥效。而人源抗體由于序列與人體自身的受體更接近，在進入人體之后更難被免疫系統(tǒng)識別，當重復用藥時藥效減弱程度較鼠源CAR-T更小。

而相較于噬菌體展示技術，轉基因鼠雜交瘤技術不需要經(jīng)過基因克隆、分子轉換和表達重組抗體的步驟，僅需經(jīng)過動物免疫、細胞培養(yǎng)和細胞融合、小鼠腹水制備和單抗純化就可以完成人源抗體的初篩和功能鑒定。
 

表1 基于轉基因鼠雜交瘤技術開發(fā)的已上市的治療性抗體

總之，抗體發(fā)現(xiàn)是一個包括動物免疫、分子克隆、免疫學檢測、功能評價等多個環(huán)節(jié)的綜合技術體系。各種篩選技術中，噬菌體展示抗體庫和（人源化）雜交瘤互有特點和優(yōu)勢，應用相對最廣。我們應根據(jù)疾病的發(fā)病機制和靶點的特性綜合考慮，選擇合理抗體篩選技術，從而更高效地篩選出優(yōu)質候選功能抗體。