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用慢凍速融法保存細(xì)胞的原理

瀏覽次數(shù):3914 發(fā)布日期:2022-3-18  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

一般來講,細(xì)胞轉(zhuǎn)移最有效的方法是進行低溫保存(- 70℃~- 196℃),而細(xì)胞超低溫保存的基本原理是:當(dāng)細(xì)胞處于- 70℃ 以下環(huán)境時,細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止,即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài),故而可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵,在于通過 0~- 20℃ 階段的程序降溫,在此溫度范圍內(nèi),冰晶呈針狀,極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

經(jīng)過研究人員的長期試驗,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇基本原則是慢凍速融,這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。
 


材料準(zhǔn)備

1、儀器:凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱(4℃、- 20℃、- 70℃)、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿:吸管(彎頭、直頭)、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶(250 ml、100 ml)、廢液缸。

3、塑料器皿:吸頭、槍頭、膠塞、移液管(10 ml)、15 ml 離心管、凍存管(1~2 ml)。

4、其他物品:微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5、PBS, 胎牛血清,DMSO,培養(yǎng)液,雙抗,胰蛋白酶(0.25%)。
 


細(xì)胞凍存

目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由冰晶形成的細(xì)胞損傷。

1、10% 的 DMSO+ 90% 胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細(xì)胞凍存。

2、取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來,懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至 15 ml 離心管中。

3、離心 1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,計數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為 5x10^6 /ml~1x10^7 /ml。

5、 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,凍存時間及操作者。

6、凍存:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率- 1~- 2℃/min;當(dāng)溫度達到- 25℃ 以下時,可增至- 5℃~- 10℃/min;到- 100℃ 時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入- 20℃ 冰箱 2 h,然后放入- 70℃ 冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。

細(xì)胞復(fù)蘇

1、從液氮容器中取出凍存管,直接浸入 37℃ 溫水中,并不時搖動令其盡快融化。

2、從 37℃ 水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細(xì)胞懸液,加到離心管并滴加 10 倍以上培養(yǎng)液,混勻。

3、離心,1000 rpm,5 min。

4、棄去上層清液,加入含 10% 胎牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃ 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5、次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
 


注意要點

1、冷凍越慢越好,復(fù)蘇越快越好。

2、與液氮接觸的操作,注意戴保護眼鏡和手套。細(xì)胞復(fù)蘇時,水浴中搖動小瓶易爆炸。且 DMSO 為有毒致癌品,接觸時帶好手套。

3、凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠,一般最低要達到 5x10^6 /ml。濃度視情況而定。

4、做好標(biāo)記:培養(yǎng)瓶上應(yīng)該用馬克筆做好標(biāo)記,寫上細(xì)胞名稱、代數(shù)和凍存時間。

5、對剛復(fù)蘇的細(xì)胞動作要輕柔,避免細(xì)胞破裂。

6、DMSO 對大多數(shù)細(xì)胞不敏感,所以解凍之后不需要除去 DMSO,解凍后頻繁換液會慢慢除去 DMSO。部分對 DMSO 敏感的細(xì)胞需要除去 DMSO。

7、解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清,突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會造成細(xì)胞生長不良,甚至死亡。

發(fā)布者:無錫耐思生命科技股份有限公司
聯(lián)系電話:0510-68006788
E-mail:info@cell-nest.com

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