在眾多抑郁癥的實(shí)驗(yàn)研究模型中，慢性社交挫敗應(yīng)激（Chronic social defeat stress，簡(jiǎn)稱CSDS）模型因有明顯的誘因、較好的建模成功率以及明顯的表型呈現(xiàn)而被廣泛認(rèn)可。以常用的嚙齒類動(dòng)物模型為例，其原理是將一只受試動(dòng)物與另一只具有攻擊性的動(dòng)物放一起，具攻擊性的動(dòng)物會(huì)反復(fù)、強(qiáng)勢(shì)攻擊受試動(dòng)物，使其感受社交挫敗應(yīng)激，從而引發(fā)一系列類似抑郁的行為，如社交回避行為、蔗糖偏好降低、獎(jiǎng)勵(lì)閾值增加、懸尾試驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中不動(dòng)性狀態(tài)增加、認(rèn)知障礙和快速動(dòng)眼睡眠期異常等。

本文將介紹一個(gè)常規(guī)的CSDS建模方案：將C57BL/6J小鼠與一只更大、更有攻擊性的CD-1小鼠放在一起，從而誘導(dǎo)出C57BL/6J小鼠的抑郁樣綜合征（以其在社交方面的持久障礙如社交回避為特征）。該方案整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程需要3 - 4周完成，包含三個(gè)重要階段：

1. 攻擊性CD-1小鼠的篩選階段；
2. C57BL/6J小鼠社交挫敗（Social defeat）階段；
3. C57BL/6J小鼠社交（Social interaction，簡(jiǎn)稱SI）檢測(cè)階段。

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01

實(shí)驗(yàn)材料
1.矩形大鼠飼養(yǎng)籠（長(zhǎng)48.3 cm × 寬26.7 cm × 高15.2 cm）；
2.多孔的隔離擋板（長(zhǎng)45.7 cm × 寬0.6 cm × 高15.2 cm）；
 

3.視頻追蹤設(shè)備和軟件（可用Panlab的Smart V3.0軟件）；
 

4.非透明的曠場(chǎng)（側(cè)壁包含可拆卸的有機(jī)玻璃罩，用于社交測(cè)試）；
 

 

02

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
CD-1小鼠（30-50只）、C57BL/6J小鼠（50-80只）
 

03

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
篩選階段（實(shí)驗(yàn)時(shí)間為3天）

1. 購(gòu)買(mǎi)4-6個(gè)月齡的非繁育CD-1雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)前將CD-1小鼠單籠飼養(yǎng)7天以適應(yīng)環(huán)境。（單籠飼養(yǎng)是為了培養(yǎng)并保持CD-1小鼠的攻擊性，也可通過(guò)將CD-1小鼠與2只雌鼠放置3-4天后再拿出以培養(yǎng)其攻擊性）
2. 購(gòu)買(mǎi)一大批C57BL/6J小鼠（年齡6-7周最佳），從其中選取一批鼠（可被反復(fù)用于后續(xù)的篩選），專門(mén)用于篩選CD-1攻擊鼠。
3. 對(duì)于單只CD-1小鼠的篩選而言，整個(gè)篩選過(guò)程持續(xù)3天，每天1次，每天將1只C57BL/6J小鼠放入CD-1小鼠的飼養(yǎng)籠中，持續(xù)3分鐘后再拿出；每天換不同的C57BL/6J小鼠試驗(yàn)共進(jìn)行3天。篩選標(biāo)準(zhǔn)：在三天的3分鐘篩選過(guò)程中，CD-1小鼠必須在至少連續(xù)兩天對(duì)C57BL/6J小鼠有攻擊行為；且初次攻擊的潛伏期在1分鐘內(nèi)。

社交挫敗（Social defeat）階段（實(shí)驗(yàn)時(shí)間為10天）

1. 提前一天將社交挫敗實(shí)驗(yàn)籠（含墊料）準(zhǔn)備好，并提前一晚將篩選出的CD-1小鼠放置于隔離擋板的一側(cè)籠子中；（共需10只不同的篩選好的CD-1小鼠，每天準(zhǔn)備1只）
2. 實(shí)驗(yàn)組：對(duì)于單只受試C57BL/6J小鼠而言，需接受連續(xù)10天的社交挫敗應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，每天持續(xù)5-10分鐘。每一天，將受試的C57BL/6J小鼠直接放置于準(zhǔn)備好的含CD-1小鼠的那一側(cè)實(shí)驗(yàn)籠中經(jīng)歷5-10分鐘的社交對(duì)抗，此過(guò)程稱之為直接接觸應(yīng)激。之后，將C57BL/6J小鼠放置到實(shí)驗(yàn)籠的隔離擋板的另一側(cè)，放置24小時(shí)作為間接心理應(yīng)激。此過(guò)程每只受試的C57BL/6J小鼠將每天面臨1只不同的CD-1小鼠，連續(xù)重復(fù)上述操作10天。（對(duì)于單只CD-1小鼠而言，每天可面臨多只C57BL/6J小鼠，取決于每組受試動(dòng)物的只數(shù)）注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)密切觀察，以確保高質(zhì)量的攻擊行為正常發(fā)生。高質(zhì)量的攻擊行為需滿足在實(shí)驗(yàn)的5-10分鐘內(nèi)，攻擊行為持續(xù)且周期性發(fā)生；每分鐘不少于1回合的攻擊，每回合持續(xù)時(shí)間約5-10秒。若出現(xiàn)兩只動(dòng)物互相理毛的現(xiàn)象，視為該階段實(shí)驗(yàn)失敗。
3. 對(duì)照組：選取2只同年齡段C57BL/6J小鼠，參照實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)（可以理解為將實(shí)驗(yàn)組中的CD-1小鼠替換為對(duì)照C57BL/6J小鼠），每天更換不同的實(shí)驗(yàn)籠，連續(xù)重復(fù)此操作10天。注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)密切觀察，避免兩只小鼠發(fā)生肢體沖突。10天的社交挫敗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將所有的受試C57BL/6J小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，24小時(shí)后（或根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間）進(jìn)行后續(xù)的社交檢測(cè)階段。

社交（Social interaction，簡(jiǎn)稱SI）檢測(cè)階段（實(shí)驗(yàn)時(shí)間為1天）

1. 準(zhǔn)備社交檢測(cè)需要的曠場(chǎng)，攝像系統(tǒng)以及視頻分析軟件；
2. 視頻記錄：分別將受試C57BL/6J小鼠（對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組）依次單只放入社交曠場(chǎng)中，檢測(cè)之前先讓其適應(yīng)環(huán)境1小時(shí)；之后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)入視頻記錄階段，開(kāi)啟攝像系統(tǒng)記錄C57BL/6J小鼠在曠場(chǎng)中的軌跡追蹤：先做2.5分鐘的無(wú)CD1-1小鼠的軌跡追蹤；中間間隔30秒，同時(shí)在曠場(chǎng)側(cè)壁的有機(jī)玻璃罩內(nèi)放入一只全新的攻擊性CD1-1小鼠（此只小鼠在社交挫敗階段沒(méi)被用過(guò)）；再做2.5分鐘有CD1-1小鼠后的軌跡追蹤。軟件記錄并分析該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的指標(biāo)，主要如下：a. 動(dòng)物整體的軌跡以及總行程；b. 動(dòng)物進(jìn)入不同區(qū)域（主要是社交區(qū)域，角落區(qū)域根據(jù)需要進(jìn)行記錄）的次數(shù)以及停留時(shí)間。
3. 數(shù)據(jù)分析：通過(guò)軟件記錄相關(guān)指標(biāo)之后，有兩種數(shù)據(jù)分析方法：

根據(jù)軟件的記錄分析結(jié)果，直接比較放了CD1-1小鼠以及未放CD1-1小鼠的兩個(gè)2.5分鐘中，C57BL/6J小鼠分別在社交區(qū)域花的時(shí)間，分別定義為T(mén)1和T2；

計(jì)算放置和未放置CD1-1小鼠的兩種情況下，C57BL/6J小鼠分別在社交區(qū)域花的時(shí)間比值，即T1/T2，被定義為SI比值，以SI比值等于1為分析標(biāo)準(zhǔn)。

理想狀態(tài)下，由于動(dòng)物的探索天性，在對(duì)照組的數(shù)據(jù)中，T1會(huì)大于T2，或者SI比值會(huì)大于1；而在實(shí)驗(yàn)組中，由于小鼠經(jīng)受前期的社交挫敗階段，會(huì)對(duì)同類型的CD1-1小鼠產(chǎn)生社交回避，即出現(xiàn)T1小于T2或者SI比值小于1的數(shù)據(jù)。

然而在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)可能會(huì)指示受試C57BL/6J小鼠的兩種亞型：一組鼠的數(shù)據(jù)和對(duì)照鼠更接近，我們稱之為不易感小鼠，而另一組鼠表現(xiàn)和對(duì)照組有明顯差異，被稱之為易感小鼠。這兩種亞型的劃分對(duì)于一些疾病模型（如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙）的研究有重要意義。
 

04

注意事項(xiàng)

1. 要確保每次實(shí)驗(yàn)時(shí)CD-1小鼠的攻擊性。理論上通過(guò)篩選標(biāo)準(zhǔn)的CD-1小鼠可以使用3個(gè)月，進(jìn)行3次CSDS模型的建立，但是在每一次新的模型建立前都需要再重新篩選一次。
2. 保持C57BL/6J小鼠保持7-8周齡時(shí)做社交挫敗實(shí)驗(yàn)最佳，年齡過(guò)大（大于20周）的小鼠會(huì)降低社交挫敗的效果。
3. 社交挫敗實(shí)驗(yàn)可能使得受試動(dòng)物形成外傷。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)而言，外傷并不是必要的，而且長(zhǎng)期的暴露性外傷會(huì)影響受試動(dòng)物的后續(xù)評(píng)估。可采取的措施有：縮短社交挫敗階段的持續(xù)時(shí)間，或者適當(dāng)?shù)匾瞥�攻擊性的CD-1小鼠。
4. 在單批次的10天社交挫敗階段造模結(jié)束后，應(yīng)對(duì)整套實(shí)驗(yàn)籠具進(jìn)行滅菌消毒并擦干，防止氣味殘留對(duì)下一批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)造成干擾。

【文獻(xiàn)引用】

1.Golden, S. A., Covington, H. E., 3rd, Berton, O. & Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc 6, 1183-1191, doi:10.1038/nprot.2011.361 (2011).

2.Kim, H.-D., Call, T., Carotenuto, S., Johnson, R. & Ferguson, D. Testing Depression in Mice: a Chronic Social Defeat Stress Model. Bio-Protocol 7, doi:10.21769/BioProtoc.2203 (2017).

3.Krishnan, V. et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell 131, 391-404, doi:10.1016/j.cell.2007.09.018 (2007).