本文節(jié)選自《實(shí)驗(yàn)卒中手術(shù)學(xué)》主編：楊國(guó)源

書號(hào)：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

冰凍切片H&E染色

1、將4%多聚甲醛灌注后的大腦，用冰凍切片機(jī)切片，厚度為10~40微米。

2、將腦片貼在載玻片上，并且吹干過(guò)夜。

3、將腦片脫脂（若是腦組織直接冰凍，則不需要脫脂）：

◆ 將腦片浸沒(méi)在氯仿和100%乙醇混合物中至少1小時(shí)。

◆ 將腦片分別在100%、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分鐘，然后用蒸餾水沖洗。

注意：

必須等到片子完全干燥（沒(méi)有水滴）。如果腦片是幾天前準(zhǔn)備的，在染色之前必須放到蒸餾水中浸泡5分鐘。

4、染色步驟：

◆ 將蘇木素滴在腦片上，染色20~25分鐘。整個(gè)過(guò)程用眼睛或顯微鏡觀察，保證細(xì)胞核變藍(lán)。

◆ 用蒸餾水洗2次。

◆ 用0.25%的氨水溶液輕輕沖洗約10秒。

◆ 用蒸餾水洗2次。

◆ 用伊紅染色10秒

◆ 用蒸餾水洗2次。

◆ 用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脫水1次，每次3分鐘。

◆ 用100%乙醇與二甲苯混合液脫水3分鐘。

◆ 用二甲苯處理5分鐘

◆ 滴2~3滴封片劑，用蓋玻片封住腦片，準(zhǔn)備在顯微鏡下觀察。

石蠟切片H&E染色

1、修剪組織：如果大腦固定在4%的多聚甲醛里，那么修剪組織必須在通風(fēng)櫥里進(jìn)行。去除小腦和嗅球部分。大腦用水沖洗干凈，冠狀切片切成3份。組織放在生理鹽水中。

2、處理以及石蠟包埋：在自動(dòng)包埋機(jī)上進(jìn)行包埋。金屬盒放在機(jī)器中過(guò)夜。組織進(jìn)行梯度脫水，并用石蠟進(jìn)行包埋。

3、組織包埋的步驟:

◆ 加熱溫度控制在59~61℃；

◆ 樣品控制臺(tái)溫度在59~61℃；

◆ 冷凍臺(tái)溫度為5℃；

◆ 組織轉(zhuǎn)移到加熱臺(tái)上，浸在石蠟中，然后移至樣品控制臺(tái)。

注意：

不要把樣品放反了，同時(shí)要保持它們的方向一致。把包埋底模放在冷凍臺(tái)上，冷卻20分鐘。

4、室溫下在切片機(jī)上切片：

◆ 水浴溫度控制在45~50℃。

◆ 石蠟組織放在冰水混合物中。

◆ 室溫下設(shè)置好切片機(jī)。

◆ 45℃，吹干載玻片20分鐘。

◆ 蠟塊固定在切片機(jī)上，修整蠟塊表面，直至大腦組織出現(xiàn)。

◆ 切片，厚度可根據(jù)試驗(yàn)要求，切成4~10微米。

◆ 腦片轉(zhuǎn)移到水浴中，然后貼在載玻片上。

5、預(yù)染：載玻片在60℃的烘箱中烤片15分鐘，融化石蠟，使乙醇揮發(fā)。注意用架子架住載玻片。

6、HE染色：可以自動(dòng)也可以手動(dòng)進(jìn)行。

自動(dòng)

染色在染色機(jī)中進(jìn)行，依次用以下溶液處理：

◆ 3次二甲苯；

◆ 2次100%乙醇；

◆ 2次95%乙醇；

◆ 蘇木素染色；

◆ 2次95%乙醇；

◆ 70%乙醇；

◆ 伊紅染色；

◆ 70%乙醇；

◆ 3次二甲苯。

手動(dòng)

每一步驟約1~2分鐘，整個(gè)過(guò)程需要25~30分鐘。載玻片放入盒子中，滴2~3滴封片劑，然后用蓋玻片小心地蓋在上面。

◆ 注意事項(xiàng)：

（1）封片前片子不要干燥，封片劑將永 久地封住腦片；

（2）在完全干燥之前保證片子平整；

（3）在顯微鏡下觀察片子的染色效果。例如：如果組織在冰盒中的浸泡時(shí)間不足夠長(zhǎng)，組織看起來(lái)會(huì)有皺褶。如果漂片溫度太高，片子會(huì)碎，如果溫度太低，片子不能漂浮。

◆ 手動(dòng)的HE染色方法：

（1）3次二甲苯，每次2分鐘，脫去脂肪和蠟；

（2）100%乙醇，每片10滴；

（3）95%乙醇，2次，每片10滴；

（4）蒸餾水洗；

（5）蘇木素染色15分鐘；

（6）蒸餾水洗2次；

（7）0.25%氨水洗，直至組織變藍(lán)；

（8）蒸餾水洗2次；

（9）0.5%的伊紅染色，每片10~20滴；

（10）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

（11）100%乙醇，每片10滴；

（12）3次二甲苯，每片10滴。

蘇木素伊紅染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色或紅色。如下圖所示：