一文掌握MIQE指南的RT-qPCR發表數據的實用方法

瀏覽次數：3883　發布日期：2021-1-20　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

考慮到mRNA轉錄的高度動態特性以及樣品處理和下游處理步驟中引入的潛在變量，RT-qPCR工作流程的每個步驟的標準化方法對于可靠和可重現的結果至關重要。MIQE為這種方法提供了一份包含85個參數的清單，以確保質量結果符合任何期刊的接受標準。接下來，小編將為大家詳細介紹如何應用MIQE指南來建立一個可靠的RT-qPCR實驗流程。

▲圖1：RT-qPCR基本流程

1、實驗設計

正確的實驗設計是任何基因表達研究的關鍵。由于mRNA轉錄對與研究過程無關的外部刺激敏感，因此嚴格控制和設計實驗條件的工作是十分重要的。其中包括了確定實驗程序、對照組、重復組的類型和數量、實驗條件以及各組內的樣品處理方法等，這些對于最小化變異性至關重要（表1）。

▲表1：RT-qPCR實驗設計和樣品管理

2、RNA提取及質控

樣品需-80℃冷凍或使用RNA儲存溶液進行儲存。RNA提取程序應包括DNA酶處理步驟，以去除任何的基因組DNA污染。

確保僅使用高純度（無污染物）和高完整性（未降解）的RNA是RT-qPCR實驗工作流程中最關鍵的一點。RNA樣本中的雜質可能導致RT和PCR的抑制，從而導致不同和不正確的定量結果。由于樣品純度和完整性不相關，因此應評估兩者確定RNA樣本符合下游工作流程的最低驗收標準。

▲表2 ：核酸質量控制方法概述

3、逆轉錄

考慮到RNA酶在環境中的普遍存在，建議在質量控制評估后立即將總RNA樣本反轉錄成cDNA。這將避免RNA樣品在轉化為cDNA之前多次冷凍/解凍而降解的風險。對于RT步驟，關鍵是確保提取的RNA樣本中轉錄基因組的一致性和完整性。建議使用相同數量的總RNA，并保持所有實驗樣本的反轉錄反應時間，以最小化生物復制之間的變異性。

4、引物和擴增子設計

引物設計和靶序列的選擇是保證擴增產物特異性和高效性的關鍵。目前有許多軟件或在線網站可設計引物對和確定擴增子，比如DNAMAN、Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、Primer-Blast、BathPrimer、Primer3 Plus等等。

5、qPCR驗證

qPCR驗證是使用一組標準樣品對引物退火溫度、反應效率和特異性的適度范圍進行評估的方法。具體步驟如下：

1.根據儀器類型，選擇合適的耗材和qPCR試劑；
2.配置不同的PCR反應體系，凝膠電泳檢測引物適宜濃度以及特異性；

▲圖2：引物適宜濃度以及特異性測定

3.設置溫度梯度測試引物適宜退火溫度；

▲圖3：引物適宜退火溫度的測定

4.實驗設置NTC、NRC、POS和NEG等對照組，來監控實驗體系或污染；
5.標準曲線的建立(評價PCR效率)。

▲圖4：標準曲線，圖源:Azure Cielo™ qPCR系統

6、內參基因的選擇

在RT-qPCR實驗中，內參基因可以用于校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。一個好的內參基因應在不同時空樣本或不同處理樣本中具有相對穩定的表達水平，常見的有ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。

7、實驗重復性

基因表達實驗中有兩種可能影響結果的變異來源：

1.由于個體有機體、組織或細胞樣品之間基因表達水平的固有差異引起的生物變異性；
2.實驗過程本身的技術變異性，通常與移液器誤差、操作誤差或樣品質量和數量有關。為了減輕生物和技術變異性的影響，一般認為至少三次生物學重復和技術重復。

▲圖5 ：實驗重復的設計

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