第52-63步

徠卡101

 

組織脫水、透明、浸蠟、包埋

 

從患者到病理學(xué)家，準(zhǔn)備樣本進行診斷需要細(xì)心、經(jīng)驗以及合理的流程。

 

徠卡特地為大家整理了取材、組織脫水、透明、浸蠟、包埋以及染色等（常規(guī)、特殊、IHC以及FISH）101步操作流程，幫助大家更有效、更簡單地獲得實驗方案，避免錯誤的發(fā)生。

 

步驟五十二

使用精確的時間

🙆 正確：在染色程序中的每一步都需要是精確的時間。

🙅 錯誤：步驟時間染色要求是一致的，“如果染色時間有限”有些步驟被跳過，這可能產(chǎn)生不一致的結(jié)果。

這些組織是從同一個蠟塊切下的相同厚度，使用的是相同的HE方法，只是由不同的工作人員手工染色。結(jié)果是：宏觀上都可以看到不一致的染色結(jié)果。

 

步驟五十三

定期監(jiān)測質(zhì)量

🙆 正確：定期進行內(nèi)參玻片染色，以監(jiān)控染色質(zhì)量。

🙅 錯誤：HE染色從不使用內(nèi)參玻片，在染色出現(xiàn)問題時，很難確認(rèn)是染色試劑，染色程序或固定不良的原因。

腎組織包括各種嗜酸細(xì)胞和保存完好的核組織元素，可以可靠的評估H染色質(zhì)量。胎盤是另一種有效的陽性對照標(biāo)本。

 

步驟五十四

規(guī)范化染色條件

🙆 正確：優(yōu)化所有染色步驟：攪拌，洗滌和排水的時間。

🙅 錯誤：攪拌，洗滌和排水的時間不一致。溶劑和試劑迅速被污染。染色效果不一致。

使用自動染色儀的好處之一是攪拌、洗滌和排水時間是一致的�？杀ＷC其他變量的可控性，這將確保良好的，一致的染色結(jié)果。

 

步驟五十五

確保徹底脫蠟

🙆 正確：玻片脫蠟徹底。

🙅 錯誤：玻片脫蠟有時不完全或玻片包含殘留蠟塊�？赡軐�(dǎo)致無法染色，或不均勻染色區(qū)域。

該HE染色切片顯示整個左側(cè)區(qū)域和部分幾個較小的區(qū)域，部分染色或未染色。這是由于前期不完全脫蠟導(dǎo)致。

 

步驟五十六

定期更新試劑

🙆 正確：溶劑和染色劑被定期更換的頻率，取決于處理的玻片染色或蠟塊的數(shù)量。

🙅 錯誤：隨機的更換溶劑和染色試劑。直到染色質(zhì)量下降才會更換試劑。

很差的染色質(zhì)量，蘇木素染色效果很差，該試劑應(yīng)立即更換。

 

步驟五十七

徹底水化

🙆 正確：玻片在蘇木素染色之前需要徹底水化。

🙅 錯誤：蘇木素溶液混入酒精或二甲苯，導(dǎo)致不均勻的染色。

該皮膚表皮的蘇木素染色不均勻是由于殘余的二甲苯（和蠟）引起的。

 

步驟五十八

蘇木素質(zhì)量監(jiān)控

🙆 正確：因蘇木精染色液會逐步被玻片和染色架攜帶的試劑稀釋和繼續(xù)氧化，故蘇木素溶液的性能需要進行仔細(xì)的監(jiān)控。

🙅 錯誤：蘇木素染色能力是每天變化的并且無法知道變化規(guī)律的。例如，染色缸的表面面積，在染色過程中的通透程度，和周圍的溫度均可影響氧化速率。

同一蠟塊切同樣厚度的2張玻片，使用自動染色機，相同的程序，間隔七天H&E染色顯示，即使是肉眼觀察，染色效果的變化也是十分明顯的。

 

步驟五十九

 

🙆正確：蘇木精染色后，一般通過 Scott’s堿性自來水或氨水進行徹底的“返藍”。此方法受當(dāng)?shù)刈詠硭�的自然PH值影響。

🙅 錯誤：有時由于未完全“返藍”，細(xì)胞核會呈現(xiàn)粉紅色。細(xì)胞核在蘇木素未染（過分化）或伊紅過染也可能呈現(xiàn)粉紅色。

A.表皮細(xì)胞核的界限不清并被染成了粉紅色。原因是蘇木素染色后在堿性水中未恰當(dāng)?shù)?ldquo;返藍”（皮膚HE）。

B.蘇木素染色后怡當(dāng)“返藍”的核染色效果。這幅圖的核擁有更好的邊界（皮膚，氫和電子）。

 

步驟六十

 

🙆正確：“返藍”后的步驟需要非常徹底的清洗，以便去除自來水中殘留的堿，以防止其中的堿阻礙后續(xù)伊紅染色，引起染色淡或染色不均勻。

🙅 錯誤：不完全沖洗“返藍”（清洗后留下的殘余堿）使伊紅染色變?nèi)趸虿痪鶆颉?/p>

剩余堿對伊紅染色的影響。注意片狀染色效果（脾HE）。

 

步驟六十一

伊紅PH監(jiān)測

🙆 正確：對伊紅溶液的pH監(jiān)測。保持最佳染色，保持PH5.0。加入醋酸可便捷的降低pH值。沒有刻意監(jiān)控伊紅pH。

🙅 錯誤：當(dāng)染色強度下降選擇替換溶液（堿性自來水的攜帶帶入能引起伊紅溶液的pH上升）。

肺組織H&E染色，因伊紅染色太弱，而不可接受的染色結(jié)果。請注意，只有紅細(xì)胞部分被伊紅染色。 

 

步驟六十二

透明和蓋片前需要徹底脫水

🙆 正確：放置在二甲苯前需要徹底脫水。

🙅 錯誤：組織有時會經(jīng)過酒精步驟后進入二甲苯。在有水污染的二甲苯中透明，可能會導(dǎo)致在組織中有微小水滴的存在，該區(qū)域在顯微鏡微觀處為看不到細(xì)節(jié)的不透明區(qū)域。

整張玻片缺乏清晰度（肉眼宏觀看不岀來）。仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn)整張玻片存在微小的水滴。

 

步驟六十三

 

🙆 正確：使用前要保證蓋玻片是干的，并使用高質(zhì)量的封固劑。在使用長期貯藏的蓋玻片前必須提前確認(rèn)蓋玻片品質(zhì)，長時間（幾個月或幾年）的存儲可能導(dǎo)致蓋玻片質(zhì)量變差。

🙅 錯誤：在蓋玻片蓋片前組織只有部分完全干燥，可能造成部分核呈黑色。如果封固劑的選擇是基于價格，則該種蓋玻片長期儲存可能導(dǎo)致封固劑結(jié)晶或蓋玻片脫落。

A.在蓋玻片蓋片前組織只有部分完全干燥。這導(dǎo)致了微小氣泡被困在核內(nèi)，使其呈現(xiàn)黑色（有時被稱為“玉米片”）。

B.使用儲存了六個月的質(zhì)量差的封固劑封，,H&E玻呈現(xiàn)大量折射球晶。

 

接下來我們將會為大家?guī)�來切片、染色、正常儲存試劑等操作流程小貼士，感興趣的話可以關(guān)注我們徠卡101系列，后續(xù)我們將會為您奉上更詳盡的內(nèi)容。