同學(xué)們又是做qPCR實驗的一天，有沒有懷著忐忑又期待的心情去點開“analysis”的呢？點開之后，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線不正常，或者Cq值過大，又或者SD值太高，那這樣的實驗結(jié)果還靠譜嗎？現(xiàn)在讓小編來告訴你，qPCR實驗的成功與否，關(guān)鍵在于各組數(shù)據(jù)是否達(dá)到判定標(biāo)準(zhǔn)以及是否符合實驗預(yù)期，小小的qPCR實驗它可以變得很簡單，也可以變得很復(fù)雜，如何抓住qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵，是分析qPCR結(jié)果可信度的第一步。

qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵

qPCR數(shù)據(jù)分析主要是利用Cq值進(jìn)行計算，所以我們需要了解qPCR反應(yīng)中幾個重要的參數(shù)，根據(jù)參數(shù)的表現(xiàn)來進(jìn)行實驗評估：

 

擴(kuò)增曲線：圖1反映的是熒光信號變化量的對數(shù)與qPCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系。圖2反映的是隨著qPCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短。標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線是呈現(xiàn)出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號，然后是三個增長階段（指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期）。

 

圖1：擴(kuò)增曲線對數(shù)圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

圖2：擴(kuò)增曲線線性圖譜。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

基線：通常3-15個循環(huán)時，熒光信號變化不大，變化趨勢接近于一條直線，即擴(kuò)增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線。

閾值：是一個熒光強(qiáng)度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線，自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。手動設(shè)置是置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴(kuò)增一定要用同一個閾值。

Cq值：qPCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時一般取Cq:15-35，太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

圖3：擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

評估qPCR反應(yīng)的效果

1、擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)

為了正確地評估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。擴(kuò)增效率E在90-110%之間時，認(rèn)為擴(kuò)增接近理想情況。

R²值：評估PCR效率的另一個關(guān)鍵參數(shù)，它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果R²等于1，則可以用Y值（Cq）來準(zhǔn)確預(yù)測X值（初始模板量）。反之，如果R²等于0，就不能通過Y值來預(yù)測X值。一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²值大于0.98時，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

圖4：標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

2、重復(fù)性

重復(fù)性即是指精確度，反映多次測量值之間的接近程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就��；如果許多數(shù)據(jù)點都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。例如，假設(shè)PCR反應(yīng)效率是100%，那么2倍稀釋點之間的平均Cq間隔應(yīng)該恰為1個Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于0.250�？偟膩碚f，重復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，說明實驗的重復(fù)性較好。

圖5：8個重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

3、重現(xiàn)性

指不同批次之間或不同實驗室之間qPCR結(jié)果的變化，通常表示為拷貝數(shù)或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺獨立的Azure Cielo 儀器上檢測GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個樣本中可通過實驗精確測量的最小拷貝數(shù)，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測確定為陽性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測得到的濃度，可通過梯度稀釋樣品來確定最低檢測限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導(dǎo)致的。假設(shè)符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個拷貝。

圖7：5個數(shù)量級的動態(tài)范圍檢測。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

5、準(zhǔn)確度

反映測量值和真實值的接近程度，以倍數(shù)變化或拷貝數(shù)進(jìn)行估算。

6、特異性

指qPCR實驗中只可以檢測到目的基因，引物特異性擴(kuò)增靶序列，而不會擴(kuò)增其他基因序列。可通過凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一條帶，或通過qPCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線是否具有單峰來判斷。

圖8：溶解曲線。圖源：Azure Cielo qPCR系統(tǒng)。

Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)

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Azure  Cielo™性能展示

☑   高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

連續(xù)1000次實驗后，結(jié)果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

☑  高重復(fù)性

重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線高度重合

96孔重復(fù)結(jié)果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

變異系數(shù)（Cv）=0.002。

☑   高分辨率

準(zhǔn)確區(qū)分2倍濃度差異樣品

人內(nèi)參cDNA（GAPDH）進(jìn)行10個梯度，

2倍稀釋，3個重復(fù)，線性擬合度

R²=0.998，擴(kuò)增效率E=99.89%