肥胖和2型糖尿病的全球發病率在過去的30年中顯著增加，已嚴重危害人們的生命健康。脂肪組織被認為與該類疾病相關，因此操縱脂肪細胞的分化和成熟有望用于臨床治療。大量研究已闡明轉錄和表觀遺傳（DNA和組蛋白修飾）在脂肪發生過程中的重要作用，但是對于轉錄后調控如何影響脂肪生成，尚不清楚。

近日，華中農業大學的研究人員在這一領域取得了新進展。華中農業大學動物科學技術學院的博士研究生宋彤星和楊陽為并列第一作者，彭健和蔣思文教授為共同通訊作者。他們在《Nucleic Acids Research》上發表了題為“Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and posttranscriptional regulation to promote adipogenic differentiation”的文章，首次發現了ZFP217直接激活m6A去甲基化酶FTO的表達，并結合m6A閱讀蛋白YTHDF2，促進FTO對m6A mRNA的結合，從而促進脂肪細胞的分化。

鋅指蛋白217（Zfp217）是眾所周知的致癌蛋白，在多種癌癥中上調，對胚胎干細胞的分化至關重要。值得注意的是，Zfp217將基因轉錄與新生RNA上的m6A修飾緊密關聯，表明Zfp217在協調表觀遺傳和表觀轉錄組網絡中起關鍵作用。于是，研究人員猜測Zfp217可能通過調節m6A修飾而加速脂肪生成。

Zfp217抑制導致m6A修飾的增加

為了探索Zfp217在成脂分化中的作用，研究人員首先利用siRNA開展了功能缺失實驗。Zfp217的敲低明顯阻斷了脂肪生成，表現為油紅O染色水平下降，以及關鍵成脂基因PPARγ、aP2、LPL和脂聯素的表達水平降低。此外，利用CRISPR-Cas9系統完全敲除Zfp217基因后，3T3L1細胞中的脂肪生成完全被破壞。此外，他們還委托賽業生物（Cyagen）制備了Zfp217敲除小鼠，發現Zfp217+/-小鼠胚胎成纖維細胞的脂肪生成減少。這些結果表明Zfp217對成脂分化有著重要的影響。

為了篩查Zfp217在3T3L1細胞中的功能，研究人員通過斑點印跡和液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）檢測了mRNA中的m6A修飾。與對照組相比，利用siRNA和CRISPR-Cas9系統處理后，3T3L1細胞中的m6A水平總體上增加（圖1）。與野生型細胞相比，Zfp217+/-小鼠胚胎成纖維細胞的m6A修飾也明顯增加。這些結果表明Zfp217對細胞m6A RNA甲基化至關重要。

圖1. Zfp217抑制導致3T3L1細胞中的m6A修飾增加

Zfp217直接激活FTO的轉錄

盡管Zfp217的失活影響了m6A修飾，但Zfp217本身并不是甲基轉移酶或去甲基化酶，那么Zfp217如何抑制m6A mRNA甲基化？于是，研究人員檢測了與m6A甲基化相關的關鍵蛋白的表達。有意思的是，Zfp217被敲低后，甲基轉移酶METTL3的表達增高，而去甲基化酶FTO的表達降低。進一步的研究表明，FTO的mRNA水平受到Zfp217過表達或敲低的調控。于是，他們想驗證Zfp217是否作為轉錄因子調控FTO的表達。

研究人員利用雙熒光素酶報告系統來驗證Zfp217增強了FTO的啟動子活性，而FTO啟動子上結合序列的缺失抑制了其活性，說明Zfp217對FTO的直接調控（圖2）。同時，FTO拯救了因缺乏Zfp217而造成的脂肪生成受阻，并增加了PPARγ、aP2、LPL和脂聯素的表達。這些結果表明，Zfp217作為轉錄因子與FTO基因的啟動子結合，以增強脂肪生成。

圖2. Zfp217激活了FTO的轉錄

Zfp217與YTHDF2發生相互作用

之前的報道稱，Zfp217通過與胚胎發育和腫瘤中的其他蛋白質相互作用而發揮其功能。為了進一步探索Zfp217促進脂肪生成的分子機制，研究人員又開展了免疫沉淀（Co-IP）實驗。他們在3T3L1細胞和HEK293T細胞中都發現了Zfp217和YTHDF2之間的特異性相互作用。

為了確認亞細胞相互作用，他們分離出細胞核和細胞質組分來測定Zfp217和YTHDF2表達。他們發現，這兩種蛋白質都分布在整個細胞中，不過Zfp217在細胞質中的表達比細胞核更多。此外，共聚焦顯微鏡分析也觀察到兩種蛋白質同時位于細胞核和細胞質中，表明YTHDF2可能在Zfp217依賴的脂肪生成中發揮特定功能。

以往的研究發現，YTHDF2在熱應激下可通過抑制FTO活性來維持m6A的水平。于是，研究人員進一步分析了YTHDF2和Zfp217與FTO之間的相互作用。正如預期，FTO和Zfp217的過表達都顯示出較低的m6A水平，且YTHDF2阻斷了FTO的去甲基化酶活性，而Zfp217作為調控因子，讓平衡傾向于去甲基化（圖3）。
 

圖3. Zfp217影響了YTHDF2和FTO之間的競爭

此外，他們通過m6A RNA pull-down實驗證實了FTO和YTHDF2在靶向m6A ssRNA上的直接競爭關系。顯然，不與RNA結合的Zfp217干擾YTHDF2的位置，讓FTO與RNA結合。后續的實驗也證明，Zfp217與YTHDF2發生相互作用，以維持FTO的m6A去甲基化活性。

總的來說，該研究證明ZFP217在轉錄（激活FTO）和轉錄后（影響mRNA m6A修飾）水平參與脂肪生成的重要作用，并發現創造性的提出了ZFP217影響m6A閱讀蛋白YTHDF2和擦除器FTO競爭性結合靶mRNA的作用模型，為深入了解m6A的動態調控過程提出了新的思路。

圖4. Zfp217在脂肪生成中調控m6A修飾的示意圖

這是國際上首次報道RNA表觀修飾調控脂肪細胞生成的分子機制，是對脂肪細胞生成調控機制的全新認識，對拓展相關研究領域具有重要意義。