維真 mCherry-GFP-LC3B 自噬雙標腺相關病毒產品說明
一．關于自噬及LC3
1. 自噬
大自噬（macroautophagy），也就是通常說的自噬（autophagy），是真核細胞蛋白降解的途徑之一。自噬可以被描述為細胞質內的成分（細胞器、蛋白等）被雙層膜的囊泡包裹，形成自噬體（autophagosome），進而傳遞到溶酶體進行降解的過程。詳細來說，自噬過程與內涵體途徑（endolysosomal pathway）密不可分（見圖1）。一方面，自噬體能夠與晚期內體（late endosome）融合形成中間囊泡（amphisome）最終形成自噬溶酶體（autolysosome）；另一方面，自噬體能夠直接與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體。無論通過哪條途徑，自噬溶酶體最終通過酸性水解酶將細胞器、蛋白等消化分解。
細胞本底水平的自噬發生在營養充足的條件下，可保護細胞免受錯誤折疊蛋白或受損細胞器的影響，從而防止某些疾病的發生（如神經退行性疾病和癌癥）。饑餓等也可誘導自噬的發生，通過降解大分子物質和細胞器為細胞活動提供營養和能量。
圖1 自噬過程及其與內涵體途徑的關系
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)
2. LC3
LC3（light chain 3）簡稱于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公認的自噬標記物。哺乳動物中的LC3與酵母中的自噬相關蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。
LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸殘基，產生細胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）共價結合，形成LC3-II并定位于自噬體膜上（見圖2）。哺乳動物中的LC3可分為三種： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作為LC3的一種，同樣可以用作自噬的分子標志。
圖2 LC3在自噬體形成中的作用
(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)
二．自噬流檢測方法
細胞經自噬誘導或抑制后，需對自噬流的水平進行觀察和檢測，常用的技術手段見表1：
表1 自噬體計數及自噬流檢測方法匯總
（Mizushima et al, Cell, 2010）
其中，電鏡觀察法由于受到實驗條件和設備的限制應用范圍有限；而由于自噬過程發生快速，通過IB/WB檢測LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到實驗進行時長的影響。
想要準確檢測自噬流的變化，需要多種技術手段共同使用，才能達到理想的實驗效果，產生具有說服性的實驗結果。
三．維真自噬雙標病毒產品
|
mCherry-GFP-LC3B腺病毒 |
|
mCherry-GFP-LC3B慢病毒 |
|
mCherry-GFP-LC3B腺相關病毒 |
四．維真自噬雙標系統的工作原理
未發生自噬的細胞及含有自噬體的細胞中，由于mCherry與GFP共同表達，細胞呈現黃色熒光。當自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進而使自噬溶酶體呈現紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻（見圖3）。
圖3 mCherry-GFP-LC3B雙標系統工作原理
(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)
圖4 維真自噬雙標病毒載體圖譜
五．維真 mCherry-GFP-LC3B 自噬雙標操作方法
（一）體外實驗
以2型AAV病毒為例，維真為您推薦的MOI值104-105，是根HEK293細胞得出的數據，不同的細胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議您感染目的細胞前，進行預實驗摸索最佳MOI值，推薦使用有熒光的對照病毒來摸索條件。
1. 為了節省病毒，推薦使用96孔板進行預實驗。
2. 將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%為最佳。為保證細胞生長良好，請保證細胞貼壁過夜。
3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培養基中做1:10稀釋（10-1），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。
4. 取出提前準備好的96孔板，先確定細胞生長狀況是否良好。用準備好的病毒稀釋液替代舊培養基，注意保留未加入病毒的細胞孔作為對照組。
5. 在加入病毒稀釋液后，請在12-24h后觀察細胞狀態來確認加入的病毒量是否合適，是否因為加入的病毒量影響細胞狀態。如果細胞沒有變化，即所加病毒對細胞沒有毒性，可以繼續培養。
6. AAV病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后每天觀察細胞中熒光表達情況。
另：如果您選擇的產品沒有熒光標簽請在96小時以后的不同時間段分別收獲細胞并通過Western-Blot或其他檢測手段來檢測基因表達。
注：由于AAV組織特異性，體外感染細胞的效率比較低，所以我們強烈推薦您購買AAV用于動物實驗。
（二）體內實驗
針對小鼠/大鼠來說，研究不同的方向有不同的AAV注射方法，詳情可查閱維真官網。
六．常見問題解答
1.重組AAV 安全嗎?
迄今為止，未發現野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復制效率非常低。重組腺相關病毒（rAAV）由多個質粒（cis質粒、輔助質粒、rep/Cap質粒）組成。Cis質粒、輔助質粒與rep/Cap質粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復制的能力。
2.哪些血清型的 AAV 可供選擇？我該選用哪種AAV呢?
目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 & AAV9。請參閱下面指南中參考文獻的建議。
3.使用重組腺相關病毒rAAV傳遞基因的優勢是什么?請同時參閱轉染效率與不同細胞類型對照表，以確定哪種血清型AAV更適合您的細胞。
rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂細胞、免疫原性極小、體內表達外源基因時間長。
4.AAV 載體穩定嗎? 如何保存AAV載體?
純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。
5.訂制AAV服務，客戶需要提供哪些材料? &客戶收到的產品是怎樣的?
您可以從我們的人源全長cDNA庫(17,000預制ORF)中挑選，或者提供您的質粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標簽和AAV血清型。
基因沉默服務，請您提供確切的shRNA的序列以構建重組rAAV載體。我們的標準載體具有U6啟動子和GFP標記。
通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根據客戶的需要，提供特定體積和滴度的產品。
附：維真自噬雙標系統感染誘導自噬的HEK293細胞效果圖
