在顯微鏡的發展過程中，相差鏡觀察法的發明是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道，人眼只能區分光波的波長（顏色）和振幅（亮度）。對于無色透明的生物標本，當光線通過時，波長和振幅變化不大，在明場觀察時很難觀察到標本。

相差顯微鏡利用被觀察物體的光程差值進行觀察，也就是利用光的干涉現象，將人眼不可分辨的相差變為可分辨的振幅差，即使無色透明的物質也可以清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察，因此相差鏡觀察廣泛應用于倒置顯微鏡中。

相差顯微鏡的基本原理是把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或者減少，提高反差。在結構上，相差顯微鏡又不同于普通光學顯微鏡，具有兩個特殊之處：

1. 環形光闌（annular diaphragm）位于光源與聚光器之間，作用是透過聚光器的光線形成空心光錐，集聚到標本上。
2. 相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ，分為兩種：

     A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波和軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加明亮，形成亮反差（或稱負反差）。

     ‚B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光波和軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結構比周圍介質更暗。