一、Annexin V 檢測凋亡細胞膜的改變

試劑及溶液：

A 對于單獨購買的試劑：

   a) 10X Binding Buffer （貨號：556454）
   b) Propidium Iodide（PI，貨號：556463）：建議與以下試劑同時使用 Annexin V-FITC（貨號： 556420,556419）或 Annexin V-Biotin （貨號： 556418，556417） 
   c) Via-Probe? （貨號：555816 ）：核酸染料7-AAD。建議與以下試劑同時使用Annexin V-PE（貨號：556422，556421）或Annexin V-Biotin（貨號：556418，556417）。 
   d) 1X PBS Buffer （貨號： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 7H20, 0.24 g KH2PO4 ,加水至1L。 調整pH值至 7.2。 高壓滅菌室溫保存。

B．對于凋亡檢測試劑盒（貨號：556547）

   a) FITC Annexin V （組分編號： 51-65874X）：每個樣本5 μl用量。
   b) Propidium Iodide （PI，組分編號： 51-66211E)）：現成的核酸染料。每個樣本5 μl用量。 
   c) 10X Annexin V Binding Buffer（組分編號： 51-66121E）

操作步驟：

  1. 取Falcon試管，按標本順序編好陰性對照管和標本管號。
  2. 使用冷的PBS緩沖液洗細胞兩次，再用1xBinding Buffer緩沖液制成1x106細胞/ml的懸液。
  3. Falcon試管中加入100μl 細胞懸液。
  4. 按以下體積加入AnnexinV與核酸染料：

  5．輕輕混勻，室溫（20°C ~25°C）避光處放置15分鐘。
  6．*使用Annexin V-Biotin試劑進行檢測時: 
    ● 1xBinding Buffer緩沖液洗細胞一次，去上清。 
    ● 1xBinding Buffer緩沖液100μl溶解SAv-FITC試劑0.5μg，加入到細胞管中。 
    ● 輕輕混勻。加入5μl PI，室溫（20-25°C）避光處放置15分鐘。 
  7．各試驗管中分別加入1xBinding Buffer緩沖液400μl。1小時內上流式細胞儀測定結果。

Annexin V Blocking

待測細胞與未標記的重組Annexin V預孵育，然后進行實驗，是Annexin V細胞凋亡檢測的質量控制。原理是預先阻斷Annexin V-FITC的結合位點，這樣可以證明Annexin V-FITC凋亡分析的特異性。

   1. 使用冷的PBS緩沖液洗細胞兩次，再用1xBinding Buffer緩沖液制成1x106細胞/ml的懸液。 
   2. 在5ml的培養管中加入100μl細胞懸液（約1x105個細胞）。 
   3. 加入5-15μg純化的重組Annexin V。注意，不同的細胞系，以及凋亡的不同階段，其Annexin V位點飽和所需要的純化的重組Annexin V含量不同。某些情況下，為達到最好效果，可以減少細胞數量，0.5x105個細胞加5-15μg純化的重組Annexin V。 
   4. 輕輕混勻，室溫反應15分鐘。 
   5. 加入5μl的Annexin V-FITC或/和PI，輕輕混勻，室溫避光處放置15分鐘。 
   6. 各試驗管中分別加入1xBinding Buffer緩沖液400μl。 
   7. 1小時內上流式細胞儀測定結果。 

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