修飾肽純化的一般目標(biāo)和方法

    首先，自然來源或者重組表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)過一些粗提的步驟（例如：勻漿、離心、硫酸銨沉淀等）成為穩(wěn)定的可以用于色譜分離的樣品。

　　然后進(jìn)行捕獲色譜（capture chromatography），主要目標(biāo)是濃縮和去除大量的容易去除的雜質(zhì)，此步最關(guān)心的是流速和載量，常采用高載量、快流速凝膠。

　　經(jīng)過濃縮的部分純化的樣品進(jìn)行中級(jí)色譜（intermediate chromatography），目的是去除較難去除的雜質(zhì)，此步最關(guān)心的是分辨率，常采用高分辨率的細(xì)顆粒凝膠。

　　最后為了得到符合要求的最終產(chǎn)品，去除殘存的雜質(zhì)以及目的蛋白的多聚物或者降解片斷，進(jìn)行精制色譜（polishing chromatography），常采用具有高分辨率的凝膠過濾凝膠進(jìn)行凝膠過濾色譜。

　　2、修飾肽純化前的準(zhǔn)備工作

　　（1）樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

　　a、測(cè)定樣品在pH 2-9的穩(wěn)定性；

　　b、測(cè)定樣品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸銨中的穩(wěn)定性；

　　c、測(cè)定樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩(wěn)定性；

　　d、測(cè)定樣品在4-40℃的穩(wěn)定性；

　　e、室溫下靜置過夜，測(cè)定對(duì)蛋白水解酶的穩(wěn)定性。

　　（2）樣品預(yù)處理

　　a、去除樣品中顆粒物（0.45-0.22微米膜過濾或者10000 g離心15分鐘）

　　b、去除樣品中脂類（ 10000 g離心15分鐘或有機(jī)溶劑抽提）

　　c、去除樣品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）

　　d、抑制樣品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制劑、低溫下快速第一步分離或在蛋白酶缺陷宿主中表達(dá)重組蛋白）

　　（3）樣品的保存條件：

　　短期儲(chǔ)存（小于24小時(shí)）

　　a、避免接近或超過樣品的穩(wěn)定極限防止蛋白質(zhì)變性或沉淀

　　b、在密閉容器中冰箱冷藏

　　較長(zhǎng)期儲(chǔ)存（數(shù)天）

　　a、b、同上

　　c、加入適當(dāng)?shù)囊志鷦?/FONT>