Cultex細胞暴露技術建立呼吸道過敏反應的人肺體外模型

瀏覽次數：3533　發布日期：2014-4-9　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

方法簡介

化學品引起的呼吸道過敏反應，不論是體內還是體外，目前尚缺少有效的評價方法。因此，新實驗方法的開發收到極大的關注，特別是考慮到REACH（《化學品注冊、評估、許可和限制》）新的法規規定。應注意的是，REACH指導方針明確指出，應盡量避免動物實驗，其中，化妝品材料應在2013年全面禁止動物實驗。所以，建立體外模型顯得非常必須和十分的緊迫。

為了化學品呼吸道過敏反應的人肺體外模型的建立，我們采用Cultex技術開發一種三維共培養系統，模擬人肺肺泡區。該系統，采用細胞氣液界面暴露技術，使體外培養的細胞在完全模擬人肺部環境下暴露于氣溶膠或顆粒物質。

方法

建立三種類型的共培養系統：

雙細胞共培養模型：

•人肺上皮細胞（ECs）：A549細胞

•人肺泡巨噬細胞（AMs）：U937細胞

三細胞共培養模型，類型1和類型2：

• ECs: A549 cells

• AMs: U937 cells, differentiated to AMs with PMA

• Human immature dendritic cells (DCs): DCs differentiated from human peripheral blood monocytes

ECs種在BD細胞培養插件上，培養7天。形成上皮細胞層后，AMs種在ECs層上。對于三細胞共培養類型1，DCs培養在細胞培養插件上（如圖1A）；對于三細胞共培養類型2，DC細胞種在上皮層內側（如圖1B）。

細胞培養的終點特征：

• EC層完整性：用Millicel-ERS (Millipore)測量跨上皮電阻（TEER）。

• EC層功能：表面活性蛋白(proSP-C)染色。

• Immature DCs: Staining of DC-marker CD1a and maturation markers CD83/CD86

使用體外暴露染毒系統（Cultex）的共培養模型對呼吸敏化劑和刺激物進行暴露染毒實驗。

結果

TEER測量：電阻值隨著時間增加。最高值出現在第7天（紅色箭頭），此時對插件進行處理（圖.2）。

圖 2: 每個值是3個腔室內測量的標準偏差平均值。

Staining of surface markers: ECs中表面活性蛋白proSP-C產物，用免疫化學染色方法所示（圖.3A）。作為陰性對照，AMs沒有染色陽性proSP-C (圖. 3B)。使用免疫化學染色方法（圖.3C）和流式方法（圖.3D）分析未成熟的DCs。兩種方法表明，培養的DC具有CD86/CD83陰性表達。流式表明DC-marker CD1a細胞呈陽性（圖.3D）。

圖3：免疫細胞化學（A-C）和流式（D）的表面標記。A，B：ECs（A）和AMs（B）DAPI染色（藍色信號）和抗-proSP-C（紅色）。在ECs上檢測到ProSP-C，但是在AMs上檢測不到。C：DCs DAPI染色（藍色信號）和CD86（紅色）。大部分細胞CD86呈陰性（箭頭）。 D：DCs流式分析。

討論

以上是采用Cultex體外細胞暴露技術建立化學品呼吸道過敏反應的人肺體外模型。這種復雜三維細胞共培養體統的使用，我們能夠鑒定生物標記物的呼吸道過敏反應。由于體外暴露技術可以直接使用粉末狀顆粒物，不必要求必須具有水溶性特征，所以這一方法可擴展適用各種化學品。

關于Cultex

Cultex Laboratories GmbH 于2007由Ulrich Mohr教授與Michaela Aufderheide教授為了推進其在體外毒理領域的研究而成立。在有關空氣、揮發性化合物和復雜混合物的體外暴露分析方面的最尖端的研究、開發與實施方面，兩位創始人都有著出色的業績，而且特別注重 “真實”的暴露環境。

Cultex專注于體外暴露的毒理研究，擁有CULTEX體外暴露模塊的技術專利，并根據研究的進展不斷改進并優化體外暴露實驗設備及技術。目前已有CULTEX RFS等模塊投入到各種體外毒理相關的科研項目之中。依托側重于吸入毒理的體外毒理學新技術的發展，Cultex亦為其客戶提供全面的服務，范圍涵蓋咨詢、規劃和實施。