Matthew A. Lauber, Stephan M. Koza, 和 Kenneth J. Fountain

目的
展示GlycoWorks^TM工作流程的各方面優勢，包括在方法驗證和故障排除中適用于不同SPE型式的靈活性以及所采用的人IgG對照標準品的可行性。

背景
蛋白質的糖基化反應是十分有意義的翻譯后修飾，可以調節蛋白質的結構和功能。生物治療藥物的糖基化作用無疑是必須進行徹底表征與監測的結構特征，尤其是在多聚糖圖譜的變化與療效和/或免疫原性的變化相關時。

一套用于評價糖蛋白中N-糖的常規應用方法包括：通過PNGase F釋放出多聚糖，采用具有熒光活性的2-氨基苯甲酰胺(2-AB)進行標記，然后采用親水作用色譜法(HILIC)進行分離，最后由熒光檢測器(FLR)進行檢測(圖1)。此工作流程中，比較復雜的是樣品制備步驟。為使此過程更加直觀，沃特世(Waters®)推出了GlycoWorks，將N-糖制備與分析所需的諸多耗材組合在一起。最值得注意的是，GlycoWorks實現了HILIC SPE的前/后標記純化步驟，這對于確保方法的穩定性而言非常重要。GlycoWorks可幫助制備出N-糖用于后續分析，并為方法確認和故障排除提供不同的SPE型式(低/高通量)以及IgG對照標準品。

以下內容展示了GlycoWorks工作流程的兩個突出方面：適用于不同的SPE型式(單次用小柱和高通量板)，以及可用于方法確認和故障排除的人IgG對照標準品。

解決方案
從GlycoWorks對照標準品(部件號186007033)即人IgG中，通過兩種不同SPE型式以及各自使用維護手冊中提供的方案，制備出2-AB標記的N-糖。圖2A顯示了對照標準品中多聚糖的HILIC-FLR色譜圖，實驗采用GlycoWorks HILIC μElution 96孔板(部件號186002780)、ACQUITY UPLC GST Amide (BEH Glycan)色譜柱以及用于儀器控制和數據解析的UNIFI?。借助葡萄糖單位(GU)值，與多聚糖性能測試標準品(部件號186006349)(與對照標準品一樣基于人IgG) 進行對比，對此譜圖中豐度最高的九種多聚糖進行了分配。

使用GlycoWorks HILIC 1ml 小柱(單次用)(部件號186007080)所得色譜圖如圖2B所示。兩色譜圖顯示：無論選擇何種SPE型式，都可獲得極為相似的結果。為驗證此結果，對所分配的峰進行積分，用峰面積確定上述九種多聚糖的相對豐度(圖2C)。此分析說明了使用兩種不同型式SPE所得多聚糖的相對濃度并無顯著區別。此研究中，我們還使用GlycoWorks對照標準品評估了樣品量對多聚糖圖譜的影響。圖3以對比形式給出了采用HILIC μElution板制得的多聚糖(25 μg至2.5 μg IgG)的HILIC-FLR色譜圖。2.5 μg樣品的總回收率低于平均值，很可能是由少量的非特異性表面損失造成。盡管所處理樣品量相差十倍，但鑒定出的相對豐度高度相似，相差值≤11%。其中，峰9(G2FS1)的偏差最大，處理25 μg 和2.5 μg IgG時，偏差值分別為8.5%和7.6%。

總結
GlycoWorks工作流程適用于兩種不同的SPE型式：一種適合于高通量需求(96孔μElution提取板)，另一種適用于低通量應用(1 cc小柱)。最重要的是，結果顯示：無論選擇何種GlycoWorks SPE型式，都可獲得極為相似的多聚糖圖譜。實驗結果基于GlycoWorks工作流程分析Glycoworks對照標準品中的N-多聚糖。GlycoWorks試劑盒中包含此標準品，可用于確認分析結果的正確性，或對故障排除流程有潛在的幫助。

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