PCR技術(shù)專題：巢式PCR
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巢式PCR
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巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。
實驗方法
- 基本方案
| 實驗方法原理 |
由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。 由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。
巢式PCR反應(yīng)模式圖 |
|---|---|
| 實驗材料 |
基因樣品 |
| 試劑、試劑盒 |
PCR緩沖液 Tris·HCl KCl Taq聚合酶 |
| 儀器、耗材 |
PCR儀 |
| 實驗步驟 |
1. 目標(biāo)的DNA模板藍(lán)色的第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點的片段上并擴增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。
2. 使用圖中紅色標(biāo)記的第二套引物對第一輪PCR擴增的產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增。 第一輪 1. 大小：1192 bp 2. 初始孵育：94℃4分鐘 3. 變性：94℃45秒 4. 退火：58攝氏度45秒 5. 聚合：72攝氏度45秒 6. PCR循環(huán)：36 第二輪 1. 大小：271 bp 2. 初始溫育：95℃2分鐘 3. 變性：95℃45秒 4. 退火：60℃下45秒 5. 聚合：72攝氏度30秒 6. PCR循環(huán)：36 |
| 注意事項 |
1. 引物設(shè)計原則：每個特異性引物為24~26個堿基，Tm：64-65%，GC：44-55% 。這樣你可以同時做多個不同的TAIL PCR。
2. 在第一輪PCR結(jié)束之后，將PCR產(chǎn)物稀釋1 000倍（視情況而定）作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR的產(chǎn)物同樣稀釋1 000倍（視情況而定）作為第三輪PCR的模板，這樣依次類推。實際操作中可以搞3輪甚至更多，當(dāng)然做3輪是比較合適了，這個時候PCR的產(chǎn)物已經(jīng)是高度特異性了。 |
| 其他 |
1. 圖解
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