多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction，PCR)是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外擴(kuò)增特異性DNA（或RNA）片段的新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)是將待檢雙鏈DNA經(jīng)94℃高溫變性成單鏈作模板，然后加入一對人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴(kuò)增DNA片段的兩端互補(bǔ)，經(jīng)55℃低溫退火，引物與模板互補(bǔ)結(jié)合。在72℃條件下，結(jié)合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應(yīng)體系中的4種dNTP為原料，按堿基互補(bǔ)配對的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。所擴(kuò)增的DNA可作為下一輪擴(kuò)增反應(yīng)的模板。重復(fù)上述循環(huán)過程，經(jīng)過20～30個(gè)周期后，特異的目的DNA可擴(kuò)增百萬倍以上。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴(kuò)增條帶。

PCR方法操作簡便，靈敏度高，可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測。

乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，在我國發(fā)病率很高，而且HBV與肝硬化、原發(fā)性肝癌關(guān)系密切，因此，HBV的診斷極為重要。PCR檢測HBV-DNA敏感性明顯高于傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，且能顯示HBV在體內(nèi)復(fù)制情況，直接反映患者血液的感染性，并對模棱兩可的或與臨床表現(xiàn)不符的血清學(xué)結(jié)果，PCR技術(shù)有助于明確診斷。

【材料】

待檢血清、HBV-PCR反應(yīng)液 20管（20μl/ 管）、HBV-DNA裂解液、陽性模板、溴化乙錠、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、紫外線分析儀。

【方法】

1、標(biāo)本處理：

取混勻的血清20μl加20μl裂解液，攪勻后100℃沸水浴10分鐘，最后15000rpm/分鐘離心3分鐘，取4μl上清待檢。

2、加樣及PCR：

取反應(yīng)液一管（使用前稍加離心），加4μl待檢上清或陽性對照于底層反應(yīng)液中，混勻后高速離心片刻，然后置94℃預(yù)變性2分鐘，再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。

3、電泳與結(jié)果判斷：

取15μl 反應(yīng)液，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（5V/cm）30分鐘后，在紫外燈下觀察結(jié)果，若410bp處出現(xiàn)橙黃色帶，則HBV為陽性。

【注意事項(xiàng)】

1、反應(yīng)管中加好所有試劑后，應(yīng)立即上機(jī)擴(kuò)增，以免形成過多的二聚體。

2、陽性模板可用陽性血清代替，處理方法同上。