實驗原理

聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技術是在PCR技術基礎上發展起來的，它是一種簡單、快速、經濟的用來顯示在PCR反應產物中單堿基突變（點突變）的手段。該方法已被用做癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測，遺傳病的致病基因分析和基因診斷，基因制圖等領域。

在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于它們的內部序列而呈現出一種獨有的折疊構象，即使同樣長度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個堿基的不同會形成不同的構象。這些單鏈DNA在非變性條件下，用非變性聚凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決于其折疊構象和電泳時的溫度。

試劑與材料

1．樣本DNA（100 ng/ml）、MTHFR上下游引物（5 pmol/ml）、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反應緩沖液、4×dNTPs（2.5 mmol/L）、30%（交聯度49:1）、5×TBE緩沖液、10%過硫酸銨（現用現配）、TEMED、甲酰胺上樣緩沖液、固定液、銀染液、顯色液。

2．微量加樣器、PCR自動熱循環儀、聚凝膠電泳裝置。

實驗步驟

一、PCR反應

20 ml反應體系成分如下：

模板DNA（100 ng/ml）        1 ml

10×PCR反應緩沖液           2 ml

Taq DNA聚合酶（5 U/ml）   0.2 ml

4×dNTPs（2.5 mmol/L）      1 ml

MTHFR上下游引物          各 1 ml

ddH2O 加至終體積           20 ml

PCR反應循環參數：

95℃ 5 min；

94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30個循環；

72℃ 7 min。

反應結束后，置4℃保存。

二、非變性聚凝膠電泳

1．制備6%的非變性聚凝膠：30%聚（交聯度49:1）10 ml，5×TBE緩沖液10 ml，加蒸餾水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%過硫酸銨250 ml，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠完全聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入電泳緩沖液（1×TBE），緩沖液應高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。

2．取5 ml 擴增產物加10 ml變性上樣緩沖液混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴。

3．取5 ml混合液加到點樣孔中，以1～8 V/cm電泳4～5 h。

三、聚凝膠染色

1．拆下電泳裝置，取出聚凝膠，放到一個塑料盤內，用蒸餾水沖洗1～2遍。

2．倒入固定液，固定8～10 min。

3．用蒸餾水沖洗1～2遍；倒入銀染液，銀染10～12 min。

4．用蒸餾水沖洗若干遍；倒入顯色液，顯色至出現清晰的銀染帶。

5．用蒸餾水浸泡聚凝膠，觀察PCR-SSCP結果。

結果判斷

觀察并記錄聚凝膠上的DNA單鏈帶，根據異常泳動變位篩查突變樣本。

應用

在遺傳學方面的有廣泛的應用，例如，癌基因或抑癌基因的基因突變的篩查，遺傳病的致病基因的突變篩查和基因診斷等。

注意事項

1．靶DNA序列長度不宜過長，否則靈敏度下降。

2．DNA樣品在電場中泳動的長度一般要求在16～18 cm以上。

3．染色最好在塑料盤中進行。