感受態制備：枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備實驗
實驗方法
- 化學法
- 化學改進法
| 實驗材料 |
枯草芽孢桿菌168 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 |
SPI 培養基 EGTA SPII 培養基 檸檬酸鈉 EGTA 氫氧化鈉 KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 MgSO4 葡萄糖 酵母膏 ( NH4 )2SO4 |
| 儀器、耗材 |
培養箱 培養皿 錐形瓶 紫外分光光度計 接種環 離心管 |
| 實驗步驟 |
一、試劑配制
1. SP 鹽
0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 檸檬酸鈉。 2. CAYE (100×)
2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培養基
SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。 4. SPII 培養基 SPI 培養基加入1 %體積50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution(500 ml)
（1）0.4% (NH4)2SO4 ：2 g （2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g （3）1.2% KH2PO4 ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121°C滅菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml)
（1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g （2）121°C滅菌20 min。 7. 100×CAYE Solution(100 ml)
（1）2% Casamino acid ：2 g
（2）10% Yeast Extract：10 g （3）121°C滅菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL)
SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL (1%V)Glucose(50%w/v，115°C滅菌20 min) ：200 μL (1%V)100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium(6 mL)
SPI Medium：5.88mL (1%V)50mM CaCl2 ：60μL (1%V)250mM MgCl2：60μL 11. 100×EGTA Solution
10mmol/L EGTA 溶液，溶解時需加少量NaOH 至pH8.0。 二、實驗步驟 1. 準備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37°C 培養箱培養12 h。 2. 轉化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養基中，37°C，250 r/min 培養過夜。
3. 第二天上午取160 μl 培養液轉接至8 ml SPI 培養基中，37°C，250 r/min 培養至對數生長末期(168 約4-5 h)。
4. 取0.2 ml 生長至對數期末的培養液至2 ml SPII 培養基中，37 °C，100 r/min 培養90 分鐘。
5. 在上述SPII培養基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養10 分鐘。
6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能過高，不超過5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培養90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。
收起 |
| 注意事項 |
1. 注意儀器用品的干凈和無菌。 2. 8ml SPI 培養基要放于50 ml 離心管中培養，以保證菌體的生長狀態，不要使用玻璃試管。 3. 注意測定OD值，一定要等菌體生長至對數期后期。 4. 保證菌體的濃度，可以提高轉化率。 |
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