1. 實驗目的和要求

通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞和外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。

2. 相關知識及原理

感受態細胞(Competent cells)：

受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl₂，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態細胞(competent cell) 。

轉化（transformation）：

是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。

進入細胞的DNA分子通過復制表達，才能實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制－修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。

轉化的方法：

化學的方法(熱擊法)：使用化學試劑（如CaCl₂）制備的感受態細胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞；

電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。

克隆的篩選：

主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環素、鏈霉素等；將經過轉化后的細胞在選擇性培養基中培養，才能較容易地篩選出轉化體，即帶有異源DNA分子的受體細胞。否則，如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養基平板上，會出現成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的質粒。雖然只有那些含有被轉化質粒的細菌才能在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對于連接混合物而言，此時并不能確定哪個克隆含有插入片段。

重組質粒克隆的鑒定

鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有a- 互補、小規模制備質粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。最常用的方法是小規模制備質粒DNA進行酶切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以結合a-互補現象來篩選。

a-互補現象：

因為許多載體都帶有一個LacZ基因的調控序列和頭146個氨基酸的編碼信息，編碼a-互補肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型a-半乳糖苷酶實現基因內互補（a-互補）。當這種載體轉入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所以稱這種現象為a-互補現象。

由互補產生的β-半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－b －D－半乳糖苷(X-gal)而產生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外源DNA片段時，會造成LacZ(a-)基因的失活，破壞a-互補作用，就不能產生具有活性的酶。所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重組質粒的菌落為藍色。

3．儀器、材料和試劑

無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心機，移液器，微型離心管等；

菌株：E.coli DH5α

質粒：pBluscript KS+DNA 片段的質粒以及 pBluscript KS 空質粒；

LB培養基；含抗菌素的LB平板培養基（氨芐青霉素，濃度50-100µg／mL，X-gal 20-48µg/ml, IPTG 100 µg/ml。一般將抗生素、X-gal和IPTG配制成1000µl儲備液，用時按培養基的量再加入）；預冷CaCl₂溶液（0.1mol／L）

4．操作步驟

1）大腸桿菌感受態細胞的制備(CaCl₂法)

      (1) 從新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于3～5ml LB液體培養中，37℃振蕩培養12h左右，直至對數生長期。將該菌懸液以1:100～1:50轉接于100ml LB液體培養基中，37℃振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔20～30min測一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時停止培養；
      (2) 每組取培養液3個2ml轉入2ml離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4℃，4000r／min離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進行，速度盡量快而穩）；
      (3) 倒凈上清培養液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液輕輕懸浮細胞，冰浴；
      (4) 0～4℃，4000r／min離心10min；
      (5) 棄去上清液，加入500µll冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心懸浮細胞。0～4℃，4000r／min離心10min；
      (6) 棄去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態細胞懸液；
      (7) 制備好的感受態細胞懸液可直接用于轉化實驗，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。

2）細胞轉化 

      (1) 分別取3個100µl感受態細胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操作)，第一組，加入10 µl重組質粒DNA(體積不超過10µl) 100µl感受態細胞，此管為轉化實驗組。第二組，插入DNA片段對照組，即酶切后DNA片段25ng 100µl感受態細胞懸液；第三組，質粒DNA對照組，即1ng 未酶切pBluescript 質粒DNA十100µl感受態細胞懸液。
      (2) 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保溫1－2min，然后迅速冰上冷卻2min
      (3) 立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉化反應原液，搖勻后于37℃振蕩培養約45-60min ，使受體菌恢復正常生長狀態，并使轉化體表達抗生素基因產物(Ampr)。

3) 平板培養（有時需要稀釋）

      (1) 取各樣品培養液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養基上，涂勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。
      (2) 菌液完全被培養基吸收后，倒置培養皿，于37℃恒溫培養箱內培養過夜(12-16小時)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養，對于可以藍白斑篩選的質粒和菌株來說，此時應該能清楚地看到藍色和白色菌落。

用 CaCl₂法制備的感受態細胞，可使每微克超螺旋質粒  DNA產生5×10⁶-2×10⁷個轉化菌落。在實際工作中，每微克有10⁵以上的轉化菌落足以滿足一般的克隆實驗。

4) 檢出轉化體和計算轉化率
      統計每個培養皿中的菌落數，各實驗組培養皿內菌落生長狀況應如表所示：
      各實驗組在培養皿內菌落生長狀況及結果分析

      轉化體總數＝菌落數×（轉化反應原液總體積/涂板菌液體積）
              插入頻率＝藍色菌落數/白色菌落數
              轉化頻率＝轉化體總數/加入質粒DNA的量（計算出每微克的轉化菌落數）